盐胁迫诱导盐穗木Rev1、Rev3基因的表达分析

杜 驰 张 冀 张富春*

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046； 2.新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)

盐胁迫诱导盐穗木Rev1、Rev3基因的表达分析

杜 驰1,2张 冀1,2张富春1,2*

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046； 2.新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)

根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果，参考盐穗木HcRev1、HcRev3基因的ESTs序列设计荧光定量PCR特异性引物，建立检测盐穗木Revs基因相对表达量的荧光定量PCR方法，分析Rev1和Rev3基因在盐穗木不同浓度盐胁迫处理不同时间的转录水平。结果表明，HcRev1、HcRev3基因具有相似的表达模式，在100 mmol·L-1NaCl低盐胁迫下表达稳定，在300、500、700 mmol·L-1NaCl胁迫下，随胁迫浓度增高、胁迫时间延长，表达量升高。其中HcRev1在700 mmol·L-1NaCl胁迫14 d后达到峰值，是对照组的4.63倍。HcRev3基因在300 mmol·L-1NaCl胁迫14 d时，表达量迅速升高，是对照组的15.55倍，表达差异极显著。研究结果说明HcRev1、HcRev3基因都受盐胁迫诱导表达，提示HcRev1、HcRev3基因虽然表达量存在差异，但在盐胁迫过程中参与了DNA损伤修复。研究有助于阐明Rev1、Rev3基因在DNA损伤修复和植物耐盐性间的调控功能作用。

盐穗木；HcRev1基因；HcRev3基因；盐胁迫；表达分析

植物在外界逆境胁迫条件下，DNA会造成不同程度损伤变异甚至断裂[1]，细胞除了直接切除和逆转修复，对DNA损伤进行直接修复[2]，还可以通过避开、跨越损伤这种间接修复方式补救DNA损伤[3]。跨损伤DNA合成修复(Translesion synthesis,TLS)，其中一条重要途径是易错旁路(error-prone by-pass)，在受损伤的DNA链上，为保证遗传物质稳定遗传，损伤修复途径无法阅读DNA损伤区域，但仍然会“将错就错”的根据错误位点进行复制，避免产生缺口[4]。这种修复机制是通过降低复制的保真度，允许损伤及错误的DNA模板存在，而使复制得以继续进行，其本质就是利用DNA链上错误的碱基使子代得以完成复制，避免细胞的死亡[5]。

DNA聚合酶分为4类：A类，由γ、θ聚合酶组成；B类，包括α、δ、ε和ζ，主要参与DNA复制和修复，DNApolα参与DNA的半保留复制，DNApolδ和ε参与核苷酸切除修复途径；X类，β、λ、μ和σ，DNApolβ参与碱基切除修复途径；Y类是一类跨损伤修复聚合酶，有η、ι、κ和Rev1，DNA Polζ与这类聚合酶具有相同的修复功能[6]。DNA Polζ就是一种易误性跨损伤修复聚合酶，Rev1蛋白具有末端脱氧转移酶活性，可与Polζ配合跨越胸腺嘧啶二聚体及其他类型的DNA损伤。Rev1指导dCMP特异的插入到模板无碱基位置的对应间隙上，Rev1在模板无碱基位置的对应部位上插入1个C残基而后DNA Polζ才能进行有效延伸。Rev3和Rev7蛋白相结合形成具跨损伤合成能力的Polζ。Rev3是其催化亚基，Rev7是Polζ的辅因子，Rev7可增强Rev3蛋白稳定性及其跨损伤合成效率[7～11]。

新疆干旱荒漠盐碱地生长的盐穗木(Halostachyscaspica)隶属于藜科(Chenopodiaceae)盐穗木属(Halostachys)，对盐分适应性极强，是新疆典型的耐盐植物[12～13]。本实验前期通过RNA-seq测序技术对盐穗木盐胁迫响应的转录组测序[14]分析，发现在盐胁迫条件下，盐穗木同化枝和根中DNA损伤应激通路中相关基因的表达差异明显。由于DNA损伤修复是植物抵御各种胁迫伤害的基本应答形式，因此，探讨盐胁迫下盐穗木DNA损伤应激通路相关基因的表达，对于分析盐生植物DNA损伤应激作用机理具有重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

盐穗木种子采于新疆五家渠103团野外盐碱地(东经87.31°北纬44.29°)。播种于铺有基质(珍珠岩∶蛭石∶花土=1∶1∶3，用双子叶植物营养液拌湿)花盆中，在24±2℃，光照3 000 lux(350 μmol·m-2·s-1,16 h/8 h：昼/夜)，相对湿度为40%～60%条件下，并施以1/4 MS(Murashige and Skoog)培养液培养120 d左右。

1.2 主要仪器与试剂

普通PCR仪是Bio-Rad公司产品；荧光定量PCR仪采用美国ABI Prism® 7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)；总提取RNA使用百泰克试剂盒(北京百泰克公司)；cDNA反转录使用M-MLV反转录酶(2641A,TaKaRa)；荧光染料SYBR® Green使用(204054,QIAGEN)；质粒提取及胶回收试剂盒购自Omega公司。

1.3 盐穗木的盐胁迫处理

选取100、300、500和700 mmol·L-1NaCl处理，处理前48～72 h在托盘中加入自来水，去除干旱胁迫因素。待托盘中自来水吸净无多余水分，将胁迫所用不同浓度NaCl溶液分别淋浇在基质上，直至溶液充满基质，淋出于托盘中。将花盆置于处理前的培养环境中。各处理浓度下0 h、24 h、72 h、7 d和14 d采集样品。

1.4 Total RNA提取和反转录

称量NaCl各胁迫处理后的盐穗木根组织200 mg，用总RNA提取试剂盒(北京百泰克公司)提取总RNA，方法参照试剂盒说明书。用ND-2000和15%变性PAGE胶检测RNA浓度和质量，每份3个重复。以1 μg总RNA为模板进行逆转录(20 μL反应体系)，以Takara Oligo(dT)作为引物用M-MLV反转录酶合成cDNA。反应程序：反转录反应液30℃静置10 min；移至42℃水浴锅孵育60 min；70℃热击15 min；冰浴2 min。以此cDNA为模板进行PCR扩增。

1.5 引物设计与片段扩增

根据本课题组前期对盐胁迫下盐穗木的转录组的测序结果，调取盐穗木DNA损伤修复基因HcRev1、HcRev3的开放阅读框序列，依据实时定量引物设计原则，设计引物，普通PCR摸索扩增条件，检测引物特异性，引物序列与预期扩增片段长度见表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应扩增参数为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s；72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 qRT-PCR引物

按PCR产物纯化试剂盒(Omega公司)说明书进行PCR产物的回收。回收的片段与pEASY-T5载体(北京全式金公司)连接，操作按试剂盒说明书进行。连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞(北京全式金公司)，酶切鉴定出阳性克隆后，送上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.6HcRev1、HcRev3及HcActin基因标准曲线建立

选取测序正确的阳性克隆，提取质粒，测定浓度，以质粒为模板，用Elution Buffer将质粒进行10倍倍比稀释，置于-20℃保存备用。浓度依次稀释为：10，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6ng·μL-1，以此为模板进行定量PCR反应，并制作各基因的标准曲线。

1.7荧光定量PCR检测盐胁迫下HcRev1、HcRev3基因的表达分析

以100、300、500和700 mmol·L-1NaCl胁迫0、24、72 h，以及7和14 d后盐穗木根的cDNA为模板，采用三步法进行定量反应，参照QIAGEN(Invitrogen公司)试剂盒说明书进行qRT-PCR，使用ABI PRISM 7500实时定量PCR仪进行检测。以普通PCR确定最佳退火温度为58℃，Real-time PCR反应体系为25 μL：SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，RNase-free ddH2O 10.5 μL。PCR扩增参数设置为：95℃预变性30 s；95℃变性15 s；58℃退火30 s；72℃延伸40 s(实时荧光信号采集)；40个循环；添加熔解曲线；3份生物样品，每份组织样品添加3个技术重复，实验同时添加一个没有RNase的双蒸馏水(ddH2O)为模板的阴性对照。数据采用2-ΔΔCT法进行分析[15]，应用GraphPad Prism 5.0软件计算重复样品之间Ct均值以及标准偏差，最后使用制图功能绘制出基因在盐穗木各浓度胁迫处理组织中的相对表达柱状图。

式中：Eftarget为目的基因的扩增效率；Ef reference为内参基因的扩增效率；Control为对照组；Experiment为实验组。

2 结果与分析

2.1 引物特异性检验

以盐胁迫下盐穗木根组织cDNA为模板，HcRev1qF、HcRev1qR、HcRev3qF、HcRev3qR、HcActinqF、HcActinqR为引物进行荧光定量PCR反应。从目的基因的熔解曲线相关数据表2可以看出，HcActin基因的Tm=(82.73±0.5)℃，HcRev1的Tm=(81.18±0.5)℃，HcRev3的Tm=(80.64±0.5)℃，熔解曲线所得的Tm值都很稳定，在熔解温度时出现单一的特异性峰，说明引物的特异性良好，没有引物二聚体和非特异性条带。

表2 目的基因片段扩增标准曲线及熔解曲线相关数据

2.2 基因标准曲线建立

对两对基因的阳性标准品质粒做10-n倍梯度稀释,按照各基因不同稀释度的Ct值，制作标准曲线。HcRev1的扩增效率为91.275%，相关系数为0.997，HcRev3的扩增效率为98.241%，相关系数为0.998，HcActin基因的扩增效率为90.733%，相关系数为0.997。

2.3荧光定量PCR检测盐胁迫下HcRev1、HcRev3基因的表达分析

以HcActin基因作为内参基因，采用NaCl模拟盐胁迫，分析HcRev1、HcRev3基因在不同盐浓度胁迫处理不同时间后的表达量水平变化(图1)。结果显示HcRev1、HcRev3两个基因具有相似的表达模式，在低盐浓度100 mmol·L-1NaCl 胁迫下表达稳定，在300、500、700 mmol·L-1NaCl胁迫下，随胁迫浓度增高、胁迫时间延长，表达量呈升高趋势。由图1A可见，HcRev1在700 mmol·L-1NaCl胁迫14 d后达到峰值，是对照组的4.63倍。图1B显示HcRev3基因在300 mmol·L-1NaCl胁迫14 d时，表达量迅速升高，是对照组的15.55倍，差异表达极显著，在500、700 mmol·L-1NaCl胁迫14 d后，表达略有下降，但仍然维持在较高水平。

图1 盐穗木HcRev1(A)和HcRev3(B)基因盐胁迫下表达分析Fig.1 Relative expression of HcRev1(A)and HcRev3(B)response to salt-stress

3 讨论

由于相对定量是将目的基因PCR扩增效率看作为100%，但实际实验过程中，未经条件优化的PCR扩增效率远远达不到理论值，致使定量结果不准确[16～17]。因此，在相对定量以前进行绝对定量实验，构建标准质粒，建立标准曲线[18]，优化扩增条件，使目标基因的实际扩增效率在80%～120%[19]，得到更为可靠的实验结果，增强实验的可重复性。但这也降低了定量实验的效率，增加了实验的复杂性和难度，是一种耗时费力的工作，使得绝对定量和相对定量结合使用的文献少见报道。

研究表明在DNA跨损伤修复通路检测中发现，哺乳动物的DNApolλ、DNA polζ、Rev1、Rev3、Polη、Polι和Polκ基因表达量与肿瘤病理分级呈正相关[20]。说明DNA聚合酶相关基因的表达与生物应对外界的胁迫密切相关[21～23]。酵母研究发现，rev3突变体降低紫外及离子辐射引发的DNA损伤突变，并且可降低20%真菌的自发突变率[24]，同时说明，Rev3对polζ影响真菌的自发突变起着决定性作用；1996年克隆得到小鼠Rev3基因[25]，敲除该基因对小鼠可产生致死性损伤；1998年人Rev3基因得以克隆[26]，证实该基因表达与肿瘤组织密切相关，polζ与酵母该聚合酶具有相似性[27]，而在植物中DNA聚合酶相关基因应对逆境损伤方面鲜有报道。本研究发现，盐穗木Rev1、Rev3基因受到盐胁迫诱导表达，说明植物在盐胁迫下启动了DNA损伤修复通路中的易误性跨损伤修复途径。HcRev1和HcRev3基因在盐胁迫下表达模式相似，在低盐盐浓度胁迫下二者表达量均很稳定，但二者在高盐浓度胁迫下表达量升高倍数存在差异性，这可能与两个基因的功能及基因作用机理相关。同时说明HcRev3对盐胁迫更为敏感，并在长时间高盐胁迫下维持较高的表达水平，暗示其在易误性聚合酶DNA Polζ进行跨损伤修复过程中的作用更为重要，该基因的重要性在酵母、小鼠和人的同源基因研究中都得以证实。在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)研究中发现，在缺乏Rev1蛋白条件下，DNA Polζ仍旧可以通过插入错误碱基有效跨越模板上的胸腺嘧啶二聚体[28～30]，与本研究HcRev3表达倍数显著高于HcRev1相一致。

4 结论

本研究建立了检测盐穗木HcRev1和HcRev3基因相对表达量的荧光定量方法，分析了不同盐浓度胁迫不同时间下HcRev1和HcRev3基因在盐穗木根中的转录水平，探讨了二者响应盐胁迫的表达变化规律。结果表明HcRev1、HcRev3基因具有相似的表达模式，随盐胁迫浓度增高和胁迫时间的延长，表达量升高。证明HcRev1、HcRev3两个基因都受盐胁迫诱导表达，参与了盐穗木盐胁迫应答过程。而Rev1、Rev3基因在DNA损伤修复和植物耐盐性间的调控功能有待进一步研究。

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Supported by Special Funds of Xinjiang Key Laboratory(2014KL001)

introduction：DU Chi(1990—)，female，master student，mainly engages in research of molecular biology of plant.

date:2016-11-03

ExpressionAnalysisofRev1andRev3ofHalostachyscaspicaunderSaltStress

DU Chi1,2ZHANG Ji1,2ZHANG Fu-Chun1,2*

(1.College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046；2.Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,Urumqi 830046)

According to the transcriptome ofHalostachyscaspicaunder salt stress, the real-time PCR primers designed aboutRev1 andRev3 were referred to the ESTs of transcriptome sequencing. We established a method for detecting of mRNA transcription ofRevs by Real-time PCR, and the transcription level ofRevs in different concentration of NaCl present. Two genes have similar expression pattern, the expression levels remain stable under 100 mmol·L-1NaCl treatment. As the concentration of NaCl was increased and the stress time was prolonged, the genes relative expression levels were also gradually increased.HcRev1 gene in 700 mmol·L-1NaCl stress for 14 d was rapidly up-regulated and reached the peak level, which was 4.63-fold of the control.HcRev3 gene in 300 mmol·L-1NaCl stress for 14 d was 15.55-fold of the control with significant differences. BothHcRev1 andHcRev3 genes were induced by salt stress, although there were different expression levels ofHcRev1 andHcRev3 genes, which were involved in the DNA damage repair during salt stress.Our study could be used to clarify the regulatory function ofHcRev1 andHcRev3 genes between DNA damage-repair and salt resistance in plants.

Halostachyscaspica;HcRev1 gene;HcRev3 gene;salt stress;expression analysis

新疆重点实验室专项资金资助项目(2014KL001)

杜驰(1990—)，女，硕士研究生，主要从事植物分子生物学研究。

* 通信作者：E-mail：zfcxju@xju.edu.cn

2016-11-03

* Corresponding author：E-mail：zfcxju@xju.edu.cn

Q786

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.02.008