自噬在子宫肌瘤中作用研究

樊 凡，穆津媛

（天津市河西区妇女儿童保健和计划生育服务中心妇女保健科 300210）

·经验交流· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.035

自噬在子宫肌瘤中作用研究

樊 凡，穆津媛

（天津市河西区妇女儿童保健和计划生育服务中心妇女保健科 300210）

目的研究子宫肌瘤细胞中自噬的程度，探讨自噬对子宫肌瘤的影响。方法随机选取2013年7月至2014年6月该院因子宫肌瘤住院的患者20例，取子宫肌瘤组织和同一病例正常子宫平滑肌。其中各取10例组织消化为细胞，利用单丹黄酰尸胺（MDC）染色后检测荧光度，检测自噬囊泡数量。另取10例组织提取蛋白，利用Western blot检测自噬相关蛋白Ⅱ型微管相关蛋白轻链3（LC3-Ⅱ）、Beclin-1和P62表达水平。结果肌瘤细胞中自噬囊泡荧光度明显低于正常子宫平滑肌细胞（P<0.05），肌瘤细胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62蛋白水平也明显低于正常子宫平滑肌细胞（P<0.05）。结论子宫肌瘤细胞中自噬水平明显降低，自噬抑制可能为子宫肌瘤发生的原因之一。

子宫肌瘤；自噬；单丹黄酰尸胺；自噬相关蛋白Ⅱ型微管相关蛋白轻链3；Beclin-1；P62

子宫肌瘤是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤。育龄妇女发病率高达20.0%～25.0%，40～50岁发病率最高,且呈逐年上升趋势，发病患者常伴有腰背酸痛、子宫出血、不孕或流产等症状，对妇女正常生活造成较大影响[1]。因此，研究子宫肌瘤发病原因具有重要意义。细胞凋亡可促进受损细胞的消失，但当细胞凋亡受到抑制时，受损细胞有可能发展为肿瘤细胞。多项研究已证实，细胞凋亡的抑制是子宫肌瘤发生、发展的重要原因[2]。而近年研究发现，自噬作为一种新型的凋亡方式，也是维持内环境稳定的重要途径[3]。因此，自噬抑制是否在子宫肌瘤的发生、发展中发挥重要作用，引起了学者关注。本研究拟收集子宫肌瘤患者的肌瘤组织细胞和正常子宫平滑肌细胞，检测自噬囊泡生成情况及自噬相关蛋白Ⅱ型微管相关蛋白轻链3（LC3-Ⅱ）、Beclin-1和P62的表达程度，探讨自噬抑制在子宫肌瘤中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 Ⅱ型胶原酶、单丹黄酰尸胺（MDC，美国Sigma 公司），DMEM培养基（美国Hyclone公司），LC3Ⅱ、Beclin-1抗体（美国Santa Cruz公司），P62 抗体（美国Abcam公司）。酶标仪（美国Biotek公司），Western blot设备（中国北京六一公司）。

1.2方法

1.2.1标本采集 标本取自2013年7 月至2014年6月本院妇科因子宫肌瘤而住院的患者（经过临床医师检查、B超以及病理学检查确诊）共20例，平均年龄（45.8±3.4）岁。所有患者均接受腹腔镜下子宫动脉阻断术，术后标本经病理检查确诊是子宫平滑肌瘤。在子宫动脉阻断前，每例取大约1 cm3肌瘤组织及邻近平滑肌组织，共20例标本，10例用于MDC染色，10例用于Western blot实验。

1.2.2自噬囊泡MDC染色 无菌条件下摘取的肌瘤组织和正常子宫平滑肌组织各10例，放入至低温的DMEM培养液中,密闭低温转运至实验室。无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次后，将肌瘤组织剪碎，加入含0.2%Ⅱ型胶原酶的DMEM 培养基37℃振荡3～5 h,待组织颗粒消化至小絮状或肉眼不可见时,过滤、800×g离心5 min,收集细胞，每组细胞取5×105个，加入0.05 mmol/L的MDC染液1.5 mL于37 ℃孵育15 min，染色完成后，800×g离心5 min后弃上清液，PBS漂洗2遍后，加入800 μL PBS重悬，用酶标仪检测荧光水平（激发光波长335 nm，发射光波长518 nm）。

1.2.3自噬相关蛋白Western blot 肌瘤组织和正常平滑肌组织各10例快速转移至-80 ℃中存储，使用时放入液氮快速冷冻后研磨成粉，将研磨后物质转移到含磷酸酶及蛋白酶抑制剂的裂解液中。离心后取上清液，定量后变性，蛋白样品经过上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育。电化学发光（ECL）液浸泡聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，用荧光化学发光凝胶成像及分析蛋白条带，Quantity One软件计算蛋白条带灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。

2 结 果

2.1细胞中自噬囊泡生成水平 与正常平滑肌细胞（473.64±11.35）相比，肌瘤细胞中自噬囊泡示踪剂MDC的荧光强度（264.91±9.82）明显下降（t=43.97,P<0.05）。

2.2组织中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1和P62表达水平 与正常平滑肌细胞相比，肌瘤细胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62蛋白水平均下降（P<0.05），见表1和图1。

表1 不同细胞中LC3Ⅱ、Beclin-1和P62蛋白水平

1：正常平滑肌细胞；2： 肌瘤细胞
图1 Western blot检测细胞中LC3Ⅱ、Beclin-1和P62蛋白水平

3 讨 论

子宫肌瘤已成为严重危害妇女生殖健康的良性肿瘤，其发病率高，危害大，已引起广泛关注，但发病机制依旧不明。目前认为多种因素可致子宫肌瘤的发病：高危因素，如月经初潮年龄及产次、情志因素、吸烟、种族；性激素及其受体，如雌激素及受体、孕激素及受体、雄激素；与细胞增殖和凋亡有关的基因等[4]。其中，已经有研究证实，子宫肌瘤细胞中细胞凋亡明显下降[3]，说明细胞凋亡的抑制参与了子宫肌瘤形成的过程，机制为：凋亡属于程序性死亡，而程序性死亡是机体内一种主动的细胞死亡方式，可消除体内受损细胞，维持内环境稳定；当程序性死亡不能正常进行时，基因受损的细胞便会继续存在、复制，诱导肿瘤的发生。目前认为细胞死亡方式有3种：细胞坏死、细胞凋亡和近几年发现的细胞自噬。其中，细胞凋亡和细胞自噬均是程序性死亡方式[5]。细胞凋亡在子宫肌瘤形成过程中受到抑制，提示自噬有可能在子宫肌瘤中也受到抑制。

自噬是一种溶酶体降解途径，其将部分胞浆和受损细胞器隔离在双层膜的囊泡中，再运送到溶酶体中进行分解，最终对分解所产生的大分子予以回收利用。自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡，参与机体的生长、发育和代谢等多种过程。生理状态，如饥饿和各种应激状态，细胞毒物均能诱发自噬。在正常状态下，自噬可维持细胞内环境的稳态，保证细胞的正常生长和衰老，抑制肿瘤形成[6]。而自噬异常时则会诱导肿瘤的形成。因此，理论上自噬异常会同细胞凋亡异常一样参与子宫肌瘤形成过程。

MDC是一种特殊染料，因离子捕获与膜脂特异性结合，可积聚于自噬囊泡，故其荧光度可反映自噬囊泡生成数量[7]。本研究中发现，肌瘤细胞中MDC荧光度明显低于正常平滑肌细胞，说明肌瘤细胞中自噬率明显低于正常平滑肌细胞。

LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62均是自噬的标志蛋白。自噬作用以自噬小体的形成为特征，LC3 为其标志分子，自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转变为膜型LC3（即LC3-Ⅱ）。Beclin-1与Ⅲ型磷脂酰肌醇-激酶（PI3KC3）相互作用可促进自噬体的形成，P62在自噬体与溶酶体融合成自噬溶酶体的晚期自噬过程中被降解[8-10]。本研究发现，LC3-Ⅱ、Beclin-1在肌瘤细胞中的表达量均下降，说明自噬体生成下降，自噬减弱。而P62表达的下降，说明自噬体生成速度低于溶酶体降解速度，即自噬体蓄积减少。

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樊凡（1980-），主治医师，本科，主要从事妇科常见病、多发病的诊治工作。

R711.74

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1671-8348（2017）30-4275-03

2017-02-08

2017-04-24）