结直肠癌中LAMP2a编码蛋白的表达及临床病理意义

时帅，窦建华，唐光波，赵爽，聂勇战，郑华川

（1. 锦州医科大学附属第一医院肿瘤基础与转化实验室，辽宁 锦州 121000； 2. 第四军医大学西京消化病医院消化内科，西安 710032）

结直肠癌中LAMP2a编码蛋白的表达及临床病理意义

时帅1，窦建华2，唐光波2，赵爽1，聂勇战2，郑华川1

（1. 锦州医科大学附属第一医院肿瘤基础与转化实验室，辽宁 锦州 121000； 2. 第四军医大学西京消化病医院消化内科，西安 710032）

目的阐明结直肠癌发生发展过程中溶酶体相关膜蛋白2a（LAMP2a）的表达及临床病理意义。方法利用免疫组化检测组织芯片上结直肠癌、正常黏膜和腺瘤中LAMP2a的表达水平，探讨结肠直肠癌临床病理特征与生存时间的关系。结果结直肠癌和腺瘤中LAMP2a表达高于正常黏膜（P ＜ 0.05），LAMP2a表达与结直肠癌TNM分期、淋巴结转移呈负相关（P ＜ 0.05），与淋巴管浸润、肝转移、浸润深度和分化程度不相关（P ＞ 0.05）。Kaplan-Meier分析显示LAMP2a表达与结直肠癌预后良好不相关（P ＞0.05）。单因素生存分析显示，淋巴管浸润、血管浸润、淋巴结转移、TNM分期、肝转移、远处转移和分化等与结直肠癌患者预后差相关（P ＜ 0.05）。Cox比例危险回归模型分析表明，浸润深度和远处转移是影响结直肠癌患者生存时间的重要因素（P ＜ 0.05）。结论LAMP2a表达参与结直肠癌发生和演进过程，可能作为结直肠癌恶性生物学行为的分子标志物。

结直肠癌； 溶酶体相关膜蛋白2a； 肿瘤发生； 演进； 预后

网络出版时间：

结直肠癌是最常见的胃肠道肿瘤之一，约1/5患者确诊时已发生转移，这些患者即使接受手术切除也有复发的风险［1］，因此，寻找反映结直肠癌发生、转移的早期诊断及预后评价的分子标志物至关重要。溶酶体相关膜蛋白2a （lysosome associated membrane protein-2a，LAMP2a）编码溶酶体相关糖蛋白，是一种自噬底物的伴侣蛋白受体。LAMP2a作为伴侣蛋白的自噬受体，在肺和肝中高表达［2-3］。LAMP2a下调会导致伴侣蛋白介导的自噬（chapertone mediated autophagy，CMA）停止。多种肿瘤中LAMP2a表达升高，表明LAMP2a可能有促进肿瘤生长的作用［4］。本研究通过制备多克隆LAMP2a抗体，利用大样本结直肠癌组织芯片标本分析结直肠癌发生和演进过程中LAMP2a表达情况，比较其表达与临床病理、预后的关系，为结直肠癌发生、转移的早期诊断提供分子标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集日本神奈川县立癌中心附属医院结直肠癌（n = 407）及邻近正常黏膜（n = 407，距癌≥4 cm）石蜡标本，部分芯片组织缺失。其中，男213例，女161例，年龄24～87岁，平均年龄62.1岁。本研究通过神奈川县立癌中心和锦州医科大学伦理委员会审查，电话询问和病例查询获取结直肠癌患者的生存信息。全部病例在活检前均未化疗、放疗及生物治疗。所有标本病理医生都根据WHO标准对结直肠癌进行组织学诊断，其中高分化153例，中分化168例，低分化28例。根据国际抗癌联盟对结直肠癌进行TNM分期，其中Ⅰ～Ⅱ期183例，Ⅲ～Ⅳ期163例。部分侵袭、淋巴结转移、组织分型和TNM临床分期等信息缺失。

1.2 组织芯片制备

对HE切片进行镜下形态学观察，选取含有典型结直肠癌和癌旁组织形态特点的部位，然后确定取样部位。使用组织芯片打孔仪（KIN-1，日本AZUMAYA公司）在每个蜡块穿取组织，将其包埋在一起形成组织芯片。

1.3 免疫组化

将组织芯片蜡块以4 μ m连续切片，切片用二甲苯脱蜡4次，梯度乙醇脱苯4次（95%、80%、70%，无水乙醇），切片过蒸馏水将其放置于抗原修复液中微波炉加热修复15 min，之后用3%双氧水消除内源性过氧化物酶，用5%牛血清白蛋白封闭（BSA）。第四军医大学制备的Anti-LAMP2a抗体（1∶80）和购自万类生物公司的HRP标记的羊抗兔二抗（1∶120）分别孵育15 min，所有反应都在间歇照射微波炉中进行，每次孵育后TBST漂洗，最后二氨基联苯胺（DAB）显色，Mayer’s苏木素复染，脱水透明封片。去除一抗作为阴性对照。

1.4 判断标准

LAMP2a蛋白定位于细胞质中。由2名观察员对染色进行阳性判断，最终双方达成一致。阳性分级标准：0，阴性；1，1%～＜50%；2，50%～＜75%；3，≥75%。染色强度评分：1，弱；2，中；3，强。LAMP2a阳性表达和染色强度相乘为最终得分：-，0分；+，1～＜3分；++，3～＜6分；+++，6～＜10分。

1.5 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件分析数据，相关性检验采用Spearman等级相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，危险因素分析采用Cox比例风险回归，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌中LAMP2a蛋白的表达

免疫组化结果表明，LAMP2a定位于细胞质中，在结直肠癌组织中呈高表达（图1）。结直肠癌中LAMP2a表达强度高于正常黏膜和腺瘤，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），结直肠癌和腺瘤中LAMP2a表达差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。见表1。

图1 结直肠发生过程中LAMP2a蛋白表达 ×200Fig.1 Expression of LAMP2a protein in colorectal carcinogenesis ×200

2.2 LAMP2a蛋白表达与结直肠癌病理特征和预后的关系

如表2所示，LAMP2a蛋白表达与结直肠癌淋巴结转移和TNM分期呈负相关（P ＜ 0.05），而与患者肿瘤浸润深度、血管侵袭、淋巴管浸润和分化程度无相关性（P ＞ 0.05）。LAMP2a在年龄≥60岁人群中高表达（P ＜ 0.05）。随访374例结直肠癌患者，中位生存时间68.3个月，根据蛋白表达绘制出结直肠癌

患者的生存曲线（图2），Kaplan-Meier分析显示LAMP2a阳性表达与患者生存率无相关（P ＞ 0.05）。单因素和COX分析时，由于部分侵袭、淋巴结转移、组织分型和TNM临床分期等信息缺失，仅对291例进行数据分析，结果显示，淋巴管浸润、血管浸润、淋巴结转移、TNM分期、肝转移、远处转移和分化与结直肠癌患者预后相关（P ＜ 0.05，表3）；COX分析表明浸润深度和远处转移是影响结直肠癌患者生存时间的危险因素（P ＜ 0.05），但年龄、性别、血管浸润、淋巴结转移不是独立危险因素（P ＞ 0.05，表4）。

表1 结直肠癌发生过程中LAMP2a蛋白表达Tab.1 LAMP2a expression in colorectal carcinogenesis

表2 LAMP2a表达水平与结直肠癌临床病理特征之间的关系Tab.2 Relationship between LAMP2a expression and the clinicopathological characteristics of colorectal cancer

图2 LAMP2a蛋白表达和结直肠癌患者预后关系Fig.2 Correlation between LAMP2a expression status and prognosis of patients with colorectal cancer

LAMP2a在维持溶酶体的完整性、pH和分解代谢中起着保护性作用，使溶酶体膜免于自身消化和细胞免于甲基化。SJDIN等［5］发现阿尔兹海默症患者脑脊液中LAMP2a水平降低可以导致体内溶酶体功能障碍。从功能上来说，LAMP2a是一种溶酶体的感受器，并且参与细胞黏附。LAMP2a会产生杂合性突变，缺失50%会导致女性患者出现溶酶体储积症（Danon病）。研究中检测了多种肿瘤中LAMP2a的表达情况，在肺癌、乳腺癌、胃癌中表达明显上调。研究［6］发现，miR-487b-5p 通过 LAMP2a介导的自噬作用，可以降低肺癌细胞对于替莫唑胺的耐药性。同时LAMP2a在肿瘤细胞膜表达增高（特别是在高转移性的黑色素细胞瘤中），但在正常细胞膜表面很少检测到［7］。研究［8］发现，LAMP2a在唾液腺囊性癌

3 讨论

中表达明显高于多形性腺瘤和正常唾液腺。本研究免疫组化和统计分析结果表明，结直肠癌和腺瘤中LAMP2a表达升高，提示其作为早期事件参与结直肠癌发生过程。

LAMP1、LAMP2与选择性蛋白和半乳凝素相互作用可介导肿瘤细胞对细胞外基质的黏附作用。已经证明LAMP2的下调可以诱导乳腺癌细胞对紫杉醇的化学敏感性［9］，并且可以抑制多发性骨髓瘤细胞中的细胞增殖［10］。在胶质母细胞瘤的周围坏死区域中检测到LAMP2的表达上调，表明在神经胶质瘤中微环境变化可驱动细胞的自我吞噬［11］。DAMAGHI等［12］证实肿瘤微环境中的慢性酸中毒可将溶酶体蛋白移位到细胞表面，LAMP2在质膜中的过表达可以保护浆细胞不受酸性物质的水解。细胞表面表达LAMP2和CD63可作为恶性肿瘤血栓形成前体内血小板激活的标志物。以上这些结果表明，LAMP2过表达有助于细胞黏附和转移。有研究［13］发现，LAMP2a表达沉默后胃癌细胞生存能力下降，同时促进细胞周期演进蛋白E2F3、PCNA和CDKN1B表达下调，提示LAMP2a具有促进胃癌细胞增殖和细胞周期演进的作用。然后，本研究发现LAMP2a表达与结直肠癌TNM分期呈负相关，与其生物学功能相反。因此为了明确这个现象，增加结直肠癌标本数来研究LAMP2a的临床病理意义十分必要，此外也需要改变结直肠癌细胞中LAMP2a的表达水平，从而进一步研究其对结直肠癌恶性生物学表型的影响。

此外，ZHOU等［4］报道LAMP2a与女性食管癌和胃癌患者不良预后呈正相关关系，多变量分析表明其可以作为预测食道癌和胃癌预后的独立预后因素，而与TNM分期、组织分级等无关。本研究结果表明，LAMP2a表达与结直肠癌患者的生存时间没有相关性，这可能归因于其与结直肠癌患者多数恶性病理生物学行为无关。单因素生存分析显示淋巴管浸润、血管浸润、淋巴结转移、TNM分期、肝转移、远处转移和分化与结直肠癌患者不良预后呈正相关，多因素风险回归分析提示浸润深度和远处转移是影响其生存时间的危险因素。

综上所述，LAMP2a在结直肠癌的发生发展中起一定作用，可能会成为结直肠癌患者早期诊断的生物标志物。

表3 结直肠癌预后危险因素的单因素分析Tab.3 Univariate analysis of prognostic risk factors in patients with colorectal cancer

表4 结直肠癌患者生存的临床病理多因素分析Tab.4 Multivariate analysis of clinicopathological variables for the survival of patients with colorectal cancer

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（编辑 武玉欣）

Expression and Clinicopathological Significance of LAMP2a in Colorectal Cancer

SHI Shuai1，DOU Jianhua2，TANG Guangbo2，ZHAO Shuang1，NIE Yongzhan2，ZHENG Huachuan1

（1. Tumor Basic and Translational Laboratory，The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China；2. Department of Digestive Medicine，Xijing Hospital of Digestive Diseases，The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China）

ObjectiveTo investigate the clinicopathological and prognostic significance of lysosome-associated membrane protein-2a（LAMP2a） expression in the development of colorectal cancer.MethodsImmunohistochemistry was performed to detect the LAMP2a expression in colorectal cancer，normal mucosa，and adenoma tissues.ResultsLAMP2a expression in colorectal cancer and adenoma was higher than that in normal mucosa （P ＜ 0.05）. Further，LAMP2a expression in colorectal cancer was negatively correlated with TNM staging and lymph node metastasis （P ＜ 0.05）；however，the invasion and liver metastasis，depth of invasion and differentiation had no correlation with the lymph node （P ＞ 0.05）. Kaplan-Meier analysis showed that LAMP2a expression in colorectal cancer is not significantly correlated with good prognosis （P ＞ 0.05）. Univariate survival analysis showed that lymphatic invasion，vascular invasion，lymph node metastasis，TNM stage，liver metastasis，distant metastasis，and differentiation were correlated with poor prognosis of colorectal cancer （P ＜ 0.05）.The Cox proportional hazards regression model showed that the depth of invasion and distant metastasis were important factors affecting the survival period of patients with colorectal cancer （P ＜ 0.05）.ConclusionLAMP2a may play a role in the carcinogenesis and progression of colorectal cancer，and may be used as a molecular marker for the biological behavior of colorectal cancer.

colorectal cancer； lysosome associated membrane protein-2a； carcinogenesis； progression； prognosis

R735.3

A

0258-4646（2017）11-0970-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.003

国家自然科学基金（81472544；81672700）；辽宁省科技攻关项目（2015408001）；辽宁省百千万人才项目（2015408001）

时帅（1990-），男，硕士研究生.

郑华川，E-mail：zheng_huachuan@hotmail.com

2017-03-29