类风湿关节炎患者外周血白细胞介素-32的表达及临床意义

彭延刚, 毛海峰

(1. 湖南省邵阳市中心医院 风湿免疫科, 湖南 邵阳, 422000;2. 江西省宜春市宜春学院体育学院 体育医学系, 江西 宜春, 336000)

类风湿关节炎患者外周血白细胞介素-32的表达及临床意义

彭延刚1, 毛海峰2

(1. 湖南省邵阳市中心医院 风湿免疫科, 湖南 邵阳, 422000;2. 江西省宜春市宜春学院体育学院 体育医学系, 江西 宜春, 336000)

目的分析类风湿关节炎(RA)患者外周血白细胞介素-32(IL-32)的表达及临床意义。方法选取122例RA患者，根据活动度积分(DAS28)将其分为高活动组45例(DAS28>5.1)、中低活动组42例(DAS28≥2.6～≤5.1)和缓解期组35例(DAS28<2.6)。选取同期50例非RA结缔组织病患者作为非RA组，选取同期50名健康志愿者作为对照组。对5组研究对象血清IL-32、TNF-α水平及外周血单核细胞(PBMC)中的IL-32、TNF-α基因相对表达量进行检测和比较。结果高活动组患者PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量和血清IL-32、TNF-α水平最高，其次为中低活动组患者，非RA组患者的血清TNF-α水平显著高于缓解期组和对照组(P<0.05)。缓解期、非RA组和对照组PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量和血清IL-32水平的差异均无统计学意义(P>0.05), 缓解期组和对照组研究对象的血清TNF-α水平的差异无统计学意义(P>0.05)。RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平与RA患者的病情指标均具有相关性(P<0.05)。结论RA患者表现为外周血IL-32水平的显著升高，其水平与其疾病严重程度和活动性程度指标具有相关性，提示了IL-32可能在RA的活动性增强过程中具有重要的作用，可作为评价RA病情的辅助指标。

类风湿关节炎; 外周血; 外周血单核细胞; 白细胞介素-32

类风湿关节炎(RA)是一种多见于中年女性的自身免疫性疾病，患者的临床表现为慢性、进行性、对称性、多发性的关节炎，其病理改变为关节滑膜的慢性炎症、增生、血管翳形成，通过浸润型炎症、免疫细胞及成纤维样滑膜细胞之间的相互作用造成病理损害，对关节的侵蚀和损害呈持续性进展，最终形成关节畸形和功能丧失[1]。RA的确切发病机制至今尚未阐明，但学术界普遍认为免疫系统功能障碍在RA的发生和发展中具有重要的作用[2]。白细胞介素-32(IL-32)是一种重要的具有免疫调节功能的细胞因子，本研究探讨RA患者外周血IL-32的表达及临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月—2016年12月在医院风湿科住院或门诊就诊的122例RA患者，纳入患者均符合美国风湿病学会1987年制订的RA诊断标准，根据患者的活动度积分(DAS28)将其分为高活动组45例(DAS28>5.1)、中低活动组42例(DAS28≥2.6～≤5.1)和缓解期组35例(DAS28<2.6)。选取同期50例非RA结缔组织病患者为非RA组，其中包括系统性红斑狼疮22例，强直性脊柱炎11例，皮肌炎7例，干燥综合征4例，系统性硬化症3例，成人Still病3例。选取同期50名门诊体检的健康志愿者作为对照组，纳入研究对象均经临床检查排除结缔组织病。以上各组研究对象均排除合并心脑卒中、肝肾功能不全、糖尿病、恶性肿瘤、慢性阻塞性肺部疾病、炎症性肠病及入组时1个月内有明显急性感染性疾病症状者，排除妊娠期或哺乳期妇女。5组研究对象在年龄、性别构成、体质量等方面的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

1.2 观察指标与方法

采集各组研究对象的空腹外周静脉血标本，取3 mL血样于室温下静置2 h后以3 000 r/min的速度离心5 min后分离血清，置于-80℃冰箱中保存待测，应用酶联免疫吸附法(ELISA法)对血清中的IL-32和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平进行检测，ELISA试验盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，操作步骤严格按照使用说明书进行。取4 mL 血样经EDTA抗凝处理后，加入PBS和淋巴细胞分离液后以1 500 r/min的速度离心15 min分离外周血单核细胞(PBMC)层，加入PBS再以1 200 r/min的速度离心10 min后洗涤细胞2次，去上清加入总RNA提取剂充分溶解后置于-80℃冰箱中保存待测。

表1 5组研究对象临床资料的比较

应用总RNA提取剂提取总RNA后应用ReverTra Ace qPCR RT Kit合成cDNA。逆转录反应体系为RT Buffer 2 μL, RT Enzyme Mix 0.5 μL, Primer Mix 0.5 μL, 变性的RNA 1 μL, Nuclease-free Water 6 μL, 总计10 μL。反应条件为37 ℃反应15 min, 98 ℃反应5 min, 反应产物置于-80 ℃冰箱中保存待测。

应用实时定量聚合酶链式反应法(RT-PCR)对PBMC中的IL-32、TNF-α基因表达水平进行检测。目标RNA的引物序列: 目标RNA为IL-32的Forward引物序列为5′-TGAGGAGCAGCACCCAGAGC-3′, Reverse引物序列为5'-CCGTAGGACTGGAAAGAGGA-3′; 目标RNA为TNF-α的Forward引物序列为5′-TCAGCCTCTTCTCCTTCCTG-3′, Reverse引物序列为5′-TGAAGAGGACCTGGGAGTAG-3′。RT-PCR反应体系为SYBR GreenER qPCR SuperMix 5 μL, cDNA 0.6 μL, Forward primer 0.2 μL, Reverse primer 0.2 μL, RNase free water 4.0 μL，总计10 μL。反应条件为94℃预变性1 min, 94 ℃变性15 s, 56 ℃复性15 s, 72 ℃延伸45 s, 共反应40个循环, 72 ℃延伸7 min, 将反应产物于4 ℃下保存, IL-32、TNF-α基因的相对表达水平应2-ΔΔCt法表示。应用全自动物化仪(美国贝克曼库尔特公司生产)对RA患者的红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)等指标进行检测和分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 5组研究对象PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量的比较

5组研究对象PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量的差异均有统计学意义(F=9.126、16.336,P<0.05), 其中高活动组患者PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量显著高于其他4组，中低活动组患者PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量显著高于缓解期、非RA组和对照组(P<0.05), 而缓解期、非RA组和对照组研究对象PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 5组研究对象PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量的比较

与高活动组比较, *P<0.05;

与中低活动组比较, #P<0.05。

2.2 5组研究对象血清IL-32、TNF-α水平比较

5组研究对象血清IL-32、TNF-α水平的差异均有统计学意义(F=69.038、78.156,P<0.05), 其中高活动组患者PBMC中血清IL-32、TNF-α水平显著高于其他4组，中低活动组患者血清IL-32、TNF-α水平高于缓解期、非RA组和对照组，非RA组患者的血清TNF-α水平显著高于缓解期组和对照组(P<0.05), 而缓解期、非RA组和对照组研究对象血清IL-32水平的差异无统计学意义(P>0.05), 缓解期组和对照组研究对象的血清TNF-α水平的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 5组研究对象血清IL-32、TNF-α水平的比较 pg/mL

与高活动组比较 ,*P<0.05; 与中低活动组比较, #P<0.05;

与非RA组比较, △P<0.05。

2.3 RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平与病情指标的相关性分析

直线相关分析结果显示, RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平与DAS28评分、ESR、CRP、RF等病情指标均具有相关性(P<0.05)。见表4。

3 讨 论

RA的发生和发展涉及免疫细胞、细胞因子、免疫活性物质及神经内分泌免疫网络等多种信号系统，其过程十分复杂。研究[3-6]证实, RA患者体内存在着明显的Th1/Th2细胞功能、Th17/Treg细胞功能的失衡和B细胞功能亢进，而这些免疫功能障碍又导致了TNF-α、干扰素和白细胞介素等细胞因子的异常表达，最终成为滑膜损害、血管翳增生、破骨细胞生成、滑膜新生血管生成、骨及软骨侵蚀等RA病理改变的重要机制。

白细胞介素是最为重要的细胞因子之一，在机体的免疫调节中扮演着重要的角色，研究证实[7-10]IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-17、IL-23、IL-35、IL-37等多种白细胞介素均在RA的发生和进展中发挥着重要的作用。本研究结果显示, RA患者的血清和PBMC中的IL-32水平均显著升高，而且活动性较高RA患者的上述变化更加显著，其外周血IL-32水平与其疾病严重程度指标具有相关性，这反映了IL-32在RA的进展和活动性增强过程中具有重要的作用。

IL-32是近年来发现的一种前炎症反应细胞因子，其主要功能是诱导TNF-α、IL-1β、IL-6、核因子、促分裂原活化蛋白激酶和趋化因子的产生和释放，在炎症反应中发挥着不可取代的作用[11]。IL-32主要存在于NK细胞、T细胞、上皮细胞及PBMC中，可诱导形成炎症级联式反应、促进细胞凋亡、诱导细胞分化，对固有性和适应性免疫应答发挥调节作用[12]。相关研究结果[13]显示, IL-32的异常表达与病原体感染、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺结核、肝炎、炎症性肠病、恶性肿瘤等疾病具有密切的相关性，而且瘢痕组织成纤维细胞中在存在着明显的IL-32基因缺失，故IL-32还与成纤维细胞过度增生、胶原减少、细胞外基质过度沉积等病理过程有关。高利常等[14]和桂明等[15]均证实，在RA患者中可观察到血清和PBMC中IL-32表达水平的升高，而且其水平与RA的病情严重和骨质破坏程度等均具有相关性，提示了IL-32可作为反映RA活动度的辅助指标。

表4 RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平与病情指标的相关性分析

综上所述，RA患者表现为外周血IL-32水平的显著升高，其水平与其疾病严重程度和活动性程度指标具有相关性，提示了IL-32可能在RA的活动性增强过程中具有重要的作用，可作为评价RA病情的辅助指标。

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Expressionofinterleukin-32inperipheralbloodofpatientswithrheumatoidarthritisanditsclinicalsignificance

PENGYangang1,MAOHaifeng2

(DepartmentofRheumatology,ShaoyangCentralHospital,Shaoyang,Hu′nan, 422000; 2.DepartmentofPhysicalMedicine,PhysicalEducationCollegeofYichunUniversity,Yichun,Jiangxi, 336000)

ObjectiveTo analyze the expression of interleukin-32 (IL-32) in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis (RA) and its clinical significance.MethodsA total of 122 patients with RA were selected and divided into high activity group (DAS28>5.1, 45 cases), moderate and low activity group(DAS28≥2.6～≤5.1, 42 cases) and remission group (DAS28<2.6, 35 cases) according to the activity score (DAS28). A total of 50 patients with connective tissue diseases excluding RA were selected as the non RA group, and another 50 healthy volunteers were selected as the control group. The serum IL-32, TNF-α levels and the relative expressions of IL-32, TNF-α genes in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of the study subjects in the 5 groups were detected and compared.ResultsIn the 5 groups, the expression of serum IL-32, TNF-α levels and the relative expressions of IL-32, TNF-α mRNA of the patients in the high activity group were the highest, followed by the moderate and low activity group. The serum TNF-α level of the patients in the non RA group was higher than that in the remission group and the control group, and the differences were statistically significant (P<0.05). There were no statistically significant differences in the serum IL-32 level and the relative expressions of IL-32, TNF-α mRNA of among the patients in the remission group, the non RA group and the control group (P>0.05). There were no statistically significant difference in serum TNF-α level between the subjects in the remission group and the control group (P>0.05). The serum and PBMC IL-32, TNF-α levels of the patients with RA were correlated with the indicators of severity (P<0.05).ConclusionThe patients with RA showsignificantly increases of IL-32 levels in the peripheral blood. The level has a correlation with the indicators of disease severity and activity, which suggests that IL-32 may play an important role in the enhancement process of RA activity and can be used as the auxiliary indicator to evaluate the progression of RA.

rheumatoid arthritis; peripheral blood; peripheral blood mononuclear cells; interleukin -32

R 593.22

A

1672-2353(2017)19-052-04

10.7619/jcmp.201719015

2017-04-07

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ14705)