花生中白藜芦醇含量测定的前处理方法优化

刘 炜 ，丁小霞 ，李培武 ，喻 理 ，雷绍荣 ，杨小凤

（1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉430062；2.农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北武汉430062；3.农业部油料产品质量安全风险评估实验室（武汉），湖北武汉430062；4.四川省农业科学院分析测试中心，四川成都610066）

花生中白藜芦醇含量测定的前处理方法优化

刘 炜1，2，3，4，丁小霞1，2，3，李培武1，2，3，喻 理1，2，3，雷绍荣4，杨小凤4

（1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉430062；2.农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北武汉430062；3.农业部油料产品质量安全风险评估实验室（武汉），湖北武汉430062；4.四川省农业科学院分析测试中心，四川成都610066）

通过比较溶剂直接提取法、高速离心提取法和固相萃取柱提取法3种不同的前处理方法对花生样品进行处理，采用高效液相色谱法（HPLC）对处理后样品中的白藜芦醇含量进行测定，研究并优化花生中白藜芦醇含量测定的前处理方法。结果表明，固相萃取柱提取法效果好，回收率高，该方法的检出限为0.08 mg/kg，加标回收率在96.9%～101.0%，相对标准偏差（RSD）在1.5%～2.1%。

花生；白藜芦醇；前处理方法；高效液相色谱法

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为纯度≥98%的白藜芦醇标准品，由德国Dr.Ehrenstorfer公司生产。

1.2 试剂

Waters-2695高效液相色谱仪，仪器配Waters-2998光电二极管阵列检测器；德国IKA T18 basic匀浆机；湘仪TDZ5-WS离心机；美国N-EVAP-111氮吹浓缩仪；乙腈（色谱纯）；无水乙醇（分析纯）；氧化铝分层柱（0.074～0.149 mm）：国药集团化学试剂有限公司）；纯净水；0.45 μm有机滤膜。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制 称取白藜芦醇标准品50.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度,制成质量浓度为1 000 mg/L的白藜芦醇标准贮备液，保存于4℃。临用时，用甲醇稀释成不同浓度的标准使用液。

标准工作液系列的配制：甲醇稀释白藜芦醇标准贮备液得到 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，7.0，10.0 mg/L的混合标准溶液。

1.3.2 样品前处理 方法一（国标法）：溶剂直接提取。称取5.0 g花生粉状样品于100 mL离心管中，加入85%乙醇水溶液60 mL，再置于80℃水浴45 min，不时振摇。冷却后用滤纸过滤，残渣用少量85%乙醇水溶液洗涤后合并提取液，并定容至100 mL。吸取2 mL滤液，于5 000 r/min离心5 min，上清液待用[16]。

方法二：高速离心提取。称取5.0 g花生粉状样品于100 mL离心管中，加入85%乙醇水溶液10 mL高速匀浆2 min后，于4 000 r/min离心10 min。将上清液转入50 mL容量瓶中。残渣分别用5 mL 85%乙醇水溶液提取2次后合并提取液，并定容至50 mL。摇匀后用0.45 μm滤膜过滤，待用[17]。

方法三：固相萃取柱提取。称取5.0 g花生粉状样品于50mL离心管中，加入85%乙醇水溶液40mL置于80℃水浴45 min，不时振摇。放置过夜后吸取8 mL上清液过氧化铝层析柱，收集滤液到10 mL刻度管。40℃氮吹滤液至1 mL，用0.45 μm滤膜过滤，待用。

1.3.3 高效液相色谱条件 色谱柱条件为Waters C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温为40℃；检测波长为306 nm；流动相A为乙腈；流动相B为水；进样量为10 μL；检测器为二极管阵列检测器。梯度洗脱条件列于表1。

表1 梯度洗脱条件

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归方程的建立

在试验条件下，采集甲醇配制的7个不同浓度标准品信号绘制其标准曲线。结果表明，白藜芦醇在质量浓度为0.1～10 mg/L时，质量浓度（C，mg/L）与其峰面积（A）呈良好的线性关系，相关系数大于0.999。白藜芦醇的相关系数和检出限列于表2。

表2 线性关系试验结果

2.2 方法检出限（LOD）与定量限（LOQ）比较

按“步骤 1.2.1，1.2.2，1.2.3”3 种前处理方法得出的检出限（LOD）和定量限（LOQ）列于表3。三者比较，固相萃取柱提取法的检出限和定量限最低，可以更好地测定花生中的白藜芦醇。

表3 检出限和定量限数据

2.3 方法重复性和准确度比较

在花生粉碎样品中添加混合标准溶液，使添加质量分数分别为1.0，5.0，10.0 mg/kg。每个浓度水平重复 5 次，分别按照“按步骤 1.2.1，1.2.2，1.2.3”3 种前处理方法处理样品，进行精密度与准确度的测定，3种添加浓度的方法重复性及回收率列于表4，3种前处理方法两两之间的加标回收率差异均较大，且回收率溶剂直接提取法一＜高速离心提取法二＜固相萃取柱提取法，固相萃取柱提取法的加标回收率高于其余2种方法，重复性好于其余2种方法。

表4 样品添加回收和重复性试验（n＝5）

3 讨论与结论

本研究通过比较3种前处理方法的检出限、定量限、回收率和精密度发现，固相萃取柱提取法在获得最佳净化效果的同时可得到最佳的回收率，综合考虑，固相萃取柱提取法优于高速离心法，而高速离心法优于溶剂直接提取法。因为白藜芦醇难溶于水[18]，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂[19]，对白藜芦醇的提取率由低到高依次为丙酮＜无水乙醇＜甲醇＜乙醚＜乙酸乙酯，因为乙醇具有无毒、安全、价格低廉、易得、易回收的特点[20]，选择乙醇作为提取白藜芦醇的试剂较适宜。溶剂直接提取法提取试剂消耗量大，且提取效率不高。高速离心法乙醇提取白黎芦醇的提取率略低于固相萃取柱提取法，但提取试剂消耗较高，提取不完全。固相萃取柱提取法用85%乙醇作为提取剂，经过80℃高温提取，静置过夜，可以让白藜芦醇与萃取剂充分接触，提高萃取效率。由于白藜芦醇在植物组织中含量很低，并且粗提物中含有大量的杂质，如大黄素等蒽醌类化合物，必须对其进行分离纯化，以得到高纯度的白藜芦醇，中性氧化铝作为分离介质，利用其特有的吸附层析作用，可以将白藜芦醇与花生样品中的其他杂质实现有效分离，且对白藜芦醇不会造成死吸附，样品损失少且提取率高。花生样品经过提取净化后，采用氮吹浓缩仪对提取剂进行浓缩，可达到良好的富集效果。

通过比较溶剂直接提取、高速离心提取、固相萃取柱提取法3种不同的前处理方法对花生样品进行处理，采用高效液相色谱法（HPLC）对处理后样品中的白藜芦醇含量进行测定，最终证明固相萃取柱提取法效果好，回收率高，方法的的检出限为0.08 mg/kg，加标回收率在96.9%～101.0%，相对标准偏差（RSD）在1.5%～2.1%。

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Optimization of Pretreatment Methods for Determination of Resveratrol in Peanut

LIUWei1，2，3，4，DINGXiaoxia1，2，3，LI Peiwu1，2，3，YULi1，2，3，LEI Shaorong4，YANG Xiaofeng4
（1.Institute of Oil Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062，China；2.Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding of Oil Crops，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；3.Laboratory of Risk Assessment for Oilseeds Products（Wuhan），Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；4.Analysis and Testing Center，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China）

After comparing the recoveries of 3 different sample pretreatment methods,the levels of resveratrol content in samples were detected by High Performance Liquid Chromatography,and studied and optimized the pretreatment method for the determination of resveratrol contents of in peanuts.The results showed that the solid phase extraction method gave the best recovery data,the method detection limit was 0.08 mg/kg,the recovery was 96.9%-101.0%and the relative standard deviation was 1.5%-2.1%.

peanut；resveratrol;pretreatment method;high performance liquid chromatography

O65

A

1002-2481（2017）10-1695-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.29

白藜芦醇（resveratrol，Res）是非黄酮类的多酚化合物，是许多植物受到生物或非生物胁迫时产生的一种植物抗毒素[1]。1939年人类首次发现白藜芦醇，1940年日本人Tokaoka首次从毛叶藜芦（Veratrum grangiflorum）的根部分离得到白藜芦醇[2]。白藜芦醇有顺式和反式2种结构，其中，反式白藜芦醇的生理活性强于顺式白藜芦醇，在植物中主要以反式白藜芦醇存在，紫外照射可使反式白藜芦醇转换为顺式白藜芦醇[3]。近年来的研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化[4]、抗自由基[5]、保护肝脏、保护心血管等功能，其中，最令人瞩目和最有发展前景的是能够抑制某些癌细胞的生长、发生和增殖，因此，被誉为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物。此外，白黎芦醇具有调节免疫、抗病毒、抗细菌及真菌、抗变态反应、辐射防护、预防急性传染性非典型肺炎（非典）等药用价值[6]。因此，研究和提取植物中的白藜芦醇至关重要。目前，国内外有关植物中白藜芦醇提取分析的研究报道很多，涉及到的前处理和检测方法也越来越多、越来越先进[7-10]。高效液相色谱法具有高灵敏度、高效能和高速度的特点，广泛应用于葡萄酒、虎杖、花生等样品中白藜芦醇的检测[11-14]。HPLC法测定白藜芦醇的含量，样品前处理方法的不同将直接影响测定结果[15]。目前，对花生中白藜芦醇的检测方法基本采用GB/T 24903—2010《粮油检验花生中白藜芦醇的测定高效液相色谱法》，该法采用乙醇水溶液直接提取白藜芦醇后上机测定，未考虑花生中油脂类杂质在乙醇水溶液中溶解性好的特点对检测结果的影响。

本试验结合GB/T 24903—2010标准优化前处理方法，对花生中含有大量油脂类物质和白藜芦醇含量较低等因素进行研究，以建立提取效果好、回收率高、重复性好的检测方法。

2017-05-18

国家自然科学基金项目（31601573）；四川省财政创新能力提升工程项目（2017QNJJ-022，2015QNJJ-037）

刘 炜（1988-），女，重庆开县人，研究实习员，主要从事食品安全分析研究工作。丁小霞为通信作者。