丝胶对大鼠INS-1细胞Bcl-2蛋白表达的影响*

孙一婵，王丹丹，李东哲，刘美晓，王小杰，陈志宏

（承德医学院，河北承德 067000）

丝胶对大鼠INS-1细胞Bcl-2蛋白表达的影响*

孙一婵，王丹丹，李东哲，刘美晓，王小杰△，陈志宏△

（承德医学院，河北承德 067000）

目的:探讨蚕茧提取物—丝胶对大鼠INS-1细胞Bcl-2蛋白表达的影响。方法INS-1细胞分为三组，正常对照组、链脲佐菌素（STZ）损伤组和丝胶处理组。正常对照组细胞用不含药物的完全培养基培养；STZ损伤组细胞用完全培养基配制的STZ溶液（10mmol/L）培养24h；丝胶处理组细胞用完全培养基配制的同时含STZ（10mmol/L）和丝胶（300μg/ml）的溶液培养24h。采用Western Blotting法检测各组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达情况。结果与正常对照组相比，STZ损伤组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达明显降低(P＜0.05)；与STZ损伤组比较，丝胶处理组细胞Bcl-2蛋白的表达明显升高(P＜0.05)。结论：丝胶可能通过上调Bcl-2蛋白的表达抑制β细胞凋亡。

丝胶；INS-1细胞；Bcl-2蛋白

自1972年Kerr提出细胞凋亡（apoptosis）的概念以来，人们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究。在调控细胞凋亡的一系列原癌基因和抑制癌基因中，Bcl-2家族起着决定性的作用。Bcl-2（B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种癌基因，具有抑制凋亡的作用，并且近年来的一些研究已开始揭示其抑制凋亡的作用机制[1-2]。

丝胶（或称丝胶蛋白）为蚕茧中的水溶性蛋白，本课题组前期研究发现，丝胶可降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，且能抑制模型大鼠血糖水平的升高[3]，但丝胶降血糖的作用机制尚未明了。为此，本研究选择大鼠胰岛素瘤细胞（INS-1细胞）为研究对象，以链脲佐菌素（STZ）处理INS-1细胞模拟高血糖损伤，探讨了丝胶对INS-1细胞Bcl-2蛋白表达的作用，以期为揭示丝胶降血糖的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 丝胶的制备 称取一定量的蚕茧（黄色蚕茧，由承德医学院蚕业研究所提供），浴比1：30，1%碳酸钠浸泡30min，煮沸3h，提取两次，两次的提取液减压浓缩，浓缩液经8000nm-14000nm透析袋透析过夜，透析液冷冻干燥成粉末，-20℃冰箱保存。临用时用完全培养基配制成溶液，0.22μm滤器过滤除菌。

1.2 INS-1细胞的培养和处理 大鼠INS-1细胞（购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司）用含FBS（10%）和β-巯基乙醇（50μmol/L）的RPMI-1640培养基，在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养2天-3天，至80%-90%融合后传代，取对数生长期细胞进行实验。

INS-1细胞分为三组，正常对照组、STZ损伤组和丝胶处理组。正常对照组细胞用不含药物的完全培养基培养；STZ损伤组细胞用完全培养基配制的STZ溶液培养24h，STZ（美国Sigma公司，-20℃冰箱保存）终浓度为10mmol/L；丝胶处理组细胞用完全培养基配制的同时含STZ（终浓度为10mmol/L）和丝胶（终浓度为300μg/ml）的溶液培养24h。

1.3 倒置显微镜观察各组INS-1细胞的形态 INS-1细胞按1×105个/ml接种于6孔板，贴壁培养至对数生长期后用PBS清洗细胞，以换液的形式分别给予各组INS-1细胞不同的药物处理，孵育24h后将6孔板置于倒置显微镜下观察各组细胞的形态。

1.4 Bcl-2蛋白表达的检测 细胞培养结束后，向各组INS-1细胞中加入蛋白裂解液，以反复冻融的方式提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝生物有限公司）定量。蛋白上样量30μg，15% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗（艾博抗(上海)贸易有限公司，1：500）室温孵育2h，二抗(1：5000，美国KPL公司)室温摇床孵育2h，Super ECL Plus超敏发光液显影。扫描胶片后，应用Quantity One-v 4.6.2软件分析显影条带，以目的条带与β-actin条带的灰度比值，作为Bcl-2蛋白的相对表达水平。

1.5 统计分析 采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）的形式表示，三组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组INS-1细胞的形态 正常对照组INS-1细胞数量较多，单层生长，分布均匀，呈不规则多边形，细胞有连接融合倾向；STZ损伤组INS-1细胞间隙增宽，出现漂浮、脱落现象，贴壁细胞数量减少，细胞形态发生改变：细胞变圆，体积变小；与STZ损伤组相比，丝胶处理组细胞间隙变窄，漂浮、脱落细胞减少，细胞形态趋于正常。见图1：

图1 各组INS-1细胞的形态（×200）

2.2 各组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达情况 与正常对照组相比，STZ损伤组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达明显降低(P＜0.05)；与STZ损伤组比较，丝胶处理组细胞Bcl-2蛋白的表达明显升高(P＜0.05)。见图2、附表：

附表 各组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达情况（±s ）

附表 各组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达情况（±s ）

与正常对照组比较：1)P＜0.05；与STZ损伤组比较：2)P＜0.05

组别 n B c l-2蛋白正常对照组 3 0.9 6±0.0 1 S T Z损伤组 3 0.7 8±0.0 1 1)丝胶处理组 3 0.8 4±0.0 1 2)

图2 各组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达

3 讨论

2型糖尿病发病的主要原因是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷，但谁处于主导地位尚存在争议。有尸检发现，肥胖的2型糖尿病患者胰岛β细胞数量仅是非糖尿病（肥胖）者的50%，提示β细胞凋亡参与了2型糖尿病的发生发展[4-5]；也因此提示，有效抑制β细胞凋亡可能对于控制2型糖尿病的进展具有重要意义。

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中具有重要意义，在生物体的进化、内环境的稳定及多系统的发育中发挥重要作用。凋亡具有复杂的分子生物学机制，是多基因严格控制的过程，虽然目前凋亡过程的确切机制尚不完全清楚，但凋亡过程的紊乱可能与多种病变相关，如肿瘤、自身免疫性疾病等。Bcl-2家族是众多调控细胞凋亡的因子之一，其抑制细胞凋亡的作用可能与以下因素有关：Bcl-2可以抑制细胞色素c（Cyt c）的释放，从而抑制超氧阴离子的产生，通过抗氧化作用抑制细胞凋亡[6]；Bcl-2具有抑制Ca2+跨膜流动的作用，通过调节细胞内Ca2+的浓度调节凋亡[7]；过度表达的Bcl-2能抑制线粒体通透性的改变，并影响巨孔的形成，从而抑制凋亡[8]。

我国最早将糖尿病成书的是《黄帝内经》，《素问》提及了“消渴病”（即糖尿病）的病名，中医辩证观点认为糖尿病是一种气阴两虚的慢性代谢紊乱疾病，符合中医“多虚、多瘀”的观点，治疗原则是生精清热、润燥养阴等。蚕茧，别名蚕衣、茧黄、绵蚕等，为蚕蛾科昆虫家蚕蛾的茧壳，具有滋阴润燥、生精止渴的作用，主治肠风便血、淋痛尿血、消渴饮引等，且民间亦有蚕茧泡水辅助降糖的用法[9]。本研究前期研究发现丝胶具有明显的降血糖作用，但具体机制不明。为此，本研究以大鼠胰岛素瘤INS-1细胞为研究对象，采用STZ损伤INS-1细胞建立模型，结果显示，丝胶处理INS-1细胞可明显升高Bcl-2蛋白的表达。本研究提示，丝胶可能通过上调Bcl-2蛋白的表达抑制β细胞凋亡，从而发挥降低血糖的作用，但仍需其它研究进一步验证本研究结果，为丰富丝胶降血糖的作用机制研究提供实验资料。

[1]Khazaei S, Ramachandran V, Abdul Hamid R,et al.Flower extract of Allium atroviolaceum triggered apoptosis, activated caspase-3 and down-regulated antiapoptotic Bcl-2 gene in HeLa cancer cell line[J].Biomed Pharmacother, 2017,89:1216-1226.

[2]V erma S,Singh A,Kumari A,et al.Natural polyphenolic inhibitors against the antiapoptotic BCL-2[J].J Recept Signal Transduct Res,2017,3（74）：391-400.

[3]付秀美，钟美蓉，付文亮，等.丝胶对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影响[J].中国老年学杂志，2011，3（11）：103-105.

[4]Lee D,Kim KH,Lee J,et al. Protective effect of cirsimaritin against streptozotocin-induced apoptosis in pancreatic beta cells[J].J Pharm Pharmacol,2017,69(7):875-883.

[5]陈香，田浩明.糖尿病胰岛β细胞凋亡病因学机制[J].中国糖尿病杂志，2002，1（03）：175-177.

[6]Zhang Y,Zhao L, Li X,et al. V8,a newly synthetic flavonoid, induces apoptosis through ROS-mediated ER stress pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Arch Toxicol, 2014,88(1): 97-107.

[7]Song S, Jacobson KN, McDermott KM, et al. ATP promotes cell survival via regulation of cytosolic [Ca2+]and Bcl-2/Bax ratio in lung cancer cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2016, 310(2): C99-114.

[8]Nalluri S, Ghoshal-Gupta S, Kutiyanawalla A, et al. TIMP-1 Inhibits Apoptosisin Lung Adenocarcinoma Cells via Interaction with Bcl-2[J]. PLoS One, 2015, 10(9): e0137673.

[9]李时珍.本草纲目[M].北京：人民卫生出版社，1985.1045-1052.

EFFECTS OF SERICIN ON EXPRESSION OF BCL-2 PROTEIN IN RATS’ INS-1 CELLS

SUN Yi-chan, WANG Dan-dan, LI Dong-zhe, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the e ff ects of sericin on expression of Bcl-2 protein in rats’ INS-1 cells.Methods:INS-1 cells were divided into normal control group, streptozotocin (STZ)-injuried group and sericin-treatment group. The INS-1 cells in normal control group were cultured with complete medium without any medicine; the INS-1 cells in STZ-injuried group were cultured with complete medium containing 10mmol/L STZ; the INS-1 cells in sericin-treatment group were cultured with complete medium containing 10mmol/L STZ and 300μg/ml sericin. Western Blotting was used to detect the expression of Bcl-2 protein in INS-1 cells of each group.Results:Compared with normal control group, the Bcl-2 protein expression in INS-1 cells of STZ-injuried group decreased obviously (P＜0.05). Compared with STZ-injuried group, the Bcl-2 protein expression in INS-1 cells of sericin-treatment group increased obviously (P＜0.05).Conclusions:Sericin may inhibit beta cell apoptosis by up regulating the expression of Bcl-2 protein.

Sericin; INS-1 cells; Bcl-2 protein

*国家自然科学基金资助项目（81441133），河北省自然科学基金资助项目（H2013406096），河北省教育厅青年基金项目（QN20131089），河北省高校重点发展学科“人体解剖与组织胚胎学”建设项目资助

△ 通讯作者

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1004-6879（2017）06-0453-03

2017-03-20）