四环素和盐酸四环素对3种纤毛虫急性毒性效应的比较研究*

赵 也 张辰笈 丁 霜 蔡兴隆 潘旭明 陈 瑛

(哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150025)

四环素和盐酸四环素对3种纤毛虫急性毒性效应的比较研究*

赵 也 张辰笈 丁 霜 蔡兴隆 潘旭明 陈 瑛#

(哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150025)

以3种纤毛虫为受试原生动物,比较了四环素和盐酸四环素对3种纤毛虫的急性毒性效应。结果表明：四环素对浮萍棘尾虫(Stylonyciialemnae)、尾草履虫(Parameciumcaudatum)和天蓝喇叭虫(Stentorcoeruleus)的24h半致死质量浓度(24h-LC50)分别为171.025 16、52.361 25、199.356 32mg/L，24h最低有影响质量浓度(24h-LOEC)分别为65.168 84、15.199 17、139.370 22mg/L；盐酸四环素对浮萍棘尾虫、尾草履虫和天蓝喇叭虫的24h-LC50分别为44.485 66、50.245 83、33.777 69mg/L，24h-LOEC分别为20.031 34、24.671 75、13.444 98mg/L。3种纤毛虫对四环素的耐受性强度为天蓝喇叭虫>浮萍棘尾虫>尾草履虫；3种纤毛虫对盐酸四环素的耐受性强度差异不明显。纤毛虫对四环素类抗生素的急性毒性较低，可用作水体环境中四环素类抗生素污染的早期监测和预警生物。

纤毛虫 四环素 盐酸四环素 急性毒性

Abstract: In this paper,three ciliates were selected as experimental subjects,and a wide range of tetracycline and tetracycline hydrochloride were employed to carry out a comparative study of acute toxicity effects. It was showed that the 24 h medial lethal concentrations (24 h-LC50) of tetracycline toStylonyciialemnae，ParameciumcaudatumandStentorcoeruleuswere 171.025 16，52.361 25，199.356 32 mg/L，respectively;the 24 h lowest observed effect concentrations (24 h-LOEC) of tetracycline were 65.168 84，15.199 17，139.370 22 mg/L，respectively. On the other hand,the 24 h-LC50of tetracycline hydrochloride toStylonyciialemnae，ParameciumcaudatumandStentorcoeruleuswere 44.485 66,50.245 83,33.777 69 mg/L，respectively;the 24 h-LOEC were 20.031 34,24.671 75,13.444 98 mg/L，respectively. The results showed that the tolerance of three ciliates to tetracycline was in the following order:Stentorcoeruleus>Stylonyciialemnae>Parameciumcaudatum. The tolerance difference of the three ciliates to tetracycline hydrochloride was not significant. The acute toxicity ofParameciumcaudatumto tetracycline antibiotics was low,so it was suitable to use ciliates for early monitoring and early warning of tetracycline antibiotic contamination in water environments.

Keywords: ciliate; tetracycline; tetracycline hydrochloride; acute toxicity

抗生素是真菌、放线菌或细菌等微生物在代谢过程中产生的一类具有杀灭或抑制其他微生物的化学物质[1]。抗生素类物质低剂量使用能够促进畜禽的生长，高剂量使用能够起到治疗疾病的作用，因此在畜禽养殖中广泛应用[2]。我国是四环素类抗生素生产、销售和使用大国，该类抗生素是我国使用最多的药物添加剂[3]。据报道，在畜禽养殖中使用的四环素类抗生素有30%(质量分数，下同)～90%以母体化合物的形式随粪便排出[4]。近年来，抗生素类物质的使用剂量不断提高，导致抗生素类物质在禽畜代谢废物中大量残留并排放至水体[5-6]。抗生素的长期暴露对水生生物产生毒性影响，并通过食物链富集、浓缩而传递，最终对人类健康造成危害[7]。

目前,四环素类抗生素对水生生物的生态毒性研究多以鱼类和藻类等多细胞动物或植物为受试材料,对原生动物的影响研究鲜有报道[8-12]。原生动物以藻类、细菌及有机物碎屑为食，绝大多数原生动物可以充当其他多细胞水生动物的食物，处于食物链较底端。原生动物在水生生态系统的物质循环和能量流动中具有重要作用，同时原生动物对环境因子敏感，可将毒性效应沿食物链传递[13]。本研究以3种纤毛虫为受试原生动物，比较了四环素和盐酸四环素对3种纤毛虫的急性毒性效应，对采用原生动物早期监测和预警水体环境中四环素类抗生素污染的可行性进行了分析。

1 材料与方法

1.1 试 剂

四环素、盐酸四环素纯度均为97%，以蒸馏水作为溶剂配制成质量浓度为500 mg/L的原液备用。

1.2 受试生物

浮萍棘尾虫(Stylonyciialemnae)：多膜纲，下毛目，尖毛科，棘尾虫属[14]；尾草履虫(Parameciumcaudatum)：纤毛纲，膜口目，草履科，草履虫属[15]；天蓝喇叭虫(Stentorcoeruleus)：纤毛纲，缘毛目，喇叭科，喇叭虫属[16]。

1.3 实验方法

经过预实验得到四环素、盐酸四环素对3种纤毛虫适宜的实验梯度，分别见表1、表2。在细胞培养板上10个孔洞内各放入1只纤毛虫，并滴入0.5 mL指定浓度的四环素类抗生素溶液，置于20 ℃恒温恒湿培养箱中，24 h后观察并记录纤毛虫存活个体数，计算死亡率(N,%)。每个浓度设置6个平行实验取平均值。

表1 四环素对3种纤毛虫的急性毒性实验梯度

表2 盐酸四环素对3种纤毛虫的急性毒性实验梯度

1.4 数据处理

以纤毛虫死亡率N为因变量Y，以四环素类抗生素质量浓度(c，mg/L)的对数值lgc为自变量X，采用Origin 2016软件对实验数据进行一次函数回归分析，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析法检验差异显著性。

2 结果分析

2.1 四环素对3种纤毛虫的急性毒性效应

不同浓度下，四环素对浮萍棘尾虫的24 h急性毒性实验结果如表3所示。根据表3数据拟合得到N与lgc的回归方程为Y=119.326 78X-216.463 27(R2=0.993 28)，根据回归方程计算得出四环素对浮萍棘尾虫的24 h半致死质量浓度(24 h-LC50)为171.025 16 mg/L，其95%置信区间为145.888 14～200.488 75 mg/L；四环素对浮萍棘尾虫的24 h最低有影响质量浓度(24 h-LOEC)为65.168 84 mg/L，其95%置信区间为55.374 52～76.693 75 mg/L。

表3 四环素对浮萍棘尾虫的24 h急性毒性

不同浓度下，四环素对尾草履虫的24 h急性毒性实验结果如表4所示。根据表4数据拟合得到N与lgc的回归方程为Y=93.076 82X-110.000 28(R2=0.989 25)，由回归方程计算得出四环素对尾草履虫的24 h-LC50为52.361 25 mg/L，其95%置信区间为41.740 73～65.685 57 mg/L；四环素对尾草履虫的24 h-LOEC为15.199 17 mg/L,其95%置信区间为10.008 55～20.985 05 mg/L。

表4 四环素对尾草履虫的24 h急性毒性

不同浓度下，四环素对天蓝喇叭虫的24 h急性毒性实验结果如表5所示。根据表5数据拟合得到N与lgc的回归方程为Y=321.619 82X-689.606 34(R2=0.983 85)，由回归方程计算得出天蓝喇叭虫的24 h-LC50为199.356 32 mg/L，其95%置信区间为184.072 96～215.908 63 mg/L；四环素对天蓝喇叭虫的24 h-LOEC为139.370 22 mg/L,其95%置信区间为126.310 66～153.776 51 mg/L。

表5 四环素对天蓝喇叭虫的24 h急性毒性

2.2 盐酸四环素对3种纤毛虫的急性毒性效应

不同浓度下，盐酸四环素对浮萍棘尾虫的24 h急性毒性实验结果如表6所示。根据表6数据拟合得到N与lgc的回归方程为Y=161.869 42X-225.355 38(R2=0.987 41)，由回归方程计算得出盐酸四环素对浮萍棘尾虫的24 h-LC50为44.485 66 mg/L，其95%置信区间为35.736 33～55.377 07 mg/L；四环素对浮萍棘尾虫的24 h-LOEC为20.031 34 mg/L,其95%置信区间为16.185 64～24.790 20 mg/L。

表6 盐酸四环素对浮萍棘尾虫的24 h急性毒性

不同浓度下，盐酸四环素对尾草履虫的24 h急性毒性实验结果如表7所示。根据表7数据拟合得得到N与lgc的回归方程为Y=161.869 42X-225.355 38(R2=0.987 41)，由回归方程计算得出盐酸四环素对尾草履虫的24 h-LC50为50.245 83 mg/L，其95%置信区间为41.494 45～60.841 51 mg/L；盐酸四环素对尾草履虫的24 h-LOEC为24.671 75 mg/L,其95%置信区间为20.517 76～29.667 44 mg/L。

表7 盐酸四环素对尾草履虫的24 h急性毒性

不同浓度下，盐酸四环素对天蓝喇叭虫的24 h急性毒性实验结果如表8所示。根据表8数据拟合得到N与lgc的回归方程为Y=124.978 56X-141.045 79(R2=0.968 62)，由回归方程计算得出盐酸四环素对天蓝喇叭虫的24 h-LC50为33.777 69 mg/L，其95%置信区间为26.005 19～43.873 27 mg/L；盐酸四环素对天蓝喇叭虫的24 h-LOEC为13.444 98 mg/L,其95%置信区间为9.738 23～18.562 65 mg/L。

表8 盐酸四环素对天蓝喇叭虫的24 h急性毒性

2.3 急性毒性分析

在24 h急性毒性实验中，四环素对3种纤毛虫的24 h-LC50数值比较结果为天蓝喇叭虫>浮萍棘尾虫>尾草履虫，差异极显著(P<0.01)，说明3种纤毛虫对于四环素的耐受性强度从大到小依次排列为：天蓝喇叭虫>浮萍棘尾虫>尾草履虫。盐酸四环素对3种纤毛虫的24-LC50数值比较结果为尾草履虫>浮萍棘尾虫>天蓝喇叭虫，但差异不显著(P>0.05)，说明3种纤毛虫对于盐酸四环素的耐受性总体无差异。四环素和盐酸四环素对3种纤毛虫的24 h-LOEC差异显著性分析结果与24 h-LC50相同。

WOLLENBERGER等[17]研究发现四环素对淡水甲壳动物大型溞无效应质量浓度为340 mg/L。王慧珠等[18]的研究结果表明：四环素对鲫鱼和斑马鱼96 h半致死质量浓度(96 h-LC50)分别为322.8、406.0 mg/L,对大型溞的48 h 半数有效质量浓度(48 h-EC50)为617.2 mg/L。于振洋等[19]的急性毒性实验结果表明，盐酸四环素对秀丽线虫的12 h半致死质量浓度(12 h-LC50)为167.5 mg/L，24 h-LC50为82.9 mg/L。上述急性毒性结果均明显高于本研究中获得的3种纤毛虫对四环素和盐酸四环素的24 h-LC50，说明纤毛虫对四环素类抗生素的急性毒性更加敏感，适合对水体环境中的四环素类抗生素污染进行早期的监测和预警。

3 结论与展望

(1) 四环素对浮萍棘尾虫、尾草履虫和天蓝喇叭虫的24 h-LC50分别为171.025 16、52.361 25、199.356 32 mg/L；24 h-LOEC分别为65.168 84、15.199 17、139.370 22 mg/L。盐酸四环素对浮萍棘尾虫、尾草履虫和天蓝喇叭虫的24 h-LC50分别为44.485 66、50.245 83、33.777 69 mg/L;24 h-LOEC分别为20.031 34、24.671 75、13.444 98 mg/L。

(2) 3种纤毛虫对四环素的耐受性强度为天蓝喇叭虫>浮萍棘尾虫>尾草履虫；3种纤毛虫对盐酸四环素的耐受性强度差异不明显。3种纤毛虫对两种抗生素毒性耐受强度表现不一致，说明四环素和盐酸四环素在纤毛虫中的代谢途径可能不同，关于纤毛虫对四环素类抗生素的代谢机制有待于未来深入研究。

(3) 纤毛虫对四环素类抗生素的急性毒性相对敏感，可用于对水体环境中的四环素类抗生素污染进行早期监测和预警。

[1] 周启星,罗义,王美娥.抗生素的环境残留、生态毒性及抗性基因污染[J].生态毒理学报,2007，2(3):243-251．

[2] 刘雨霞，鲍艳宇.土壤中四环素类抗生素污染研究进展[J].环境污染与防治，2011,33(8)：81-86.

[3] 李伟明，鲍艳宇，周启星．四环素类抗生素降解途径及其主要降解产物研究进展[J].应用生态学报，2012，23(8):2300-2308．

[4] SARMAH A K，MEYER M T，BOXALL A B A.A global perspective on the use,sales,exposure pathways,occurrence,fate and effects of veterinary antibiotics (VAs) in the environment[J].Chemosphere，2006，65(5):725-759．

[5] 王冰,孙成,胡冠九.环境中抗生素残留潜在风险及其研究进展[J].环境科学与技术,2007,30(3):108-111．

[6] BECONI BARKER M G,HORNISHOR R E,VIDEMAR T G,et al.Ceftiofur hydrochloride:plasma and tissue distribution in swine following intramuscular administration at various doses[J].Veterinary Pharmacology & Therapeutics,1996,19(3):192-199.

[7] HARTMANN A,ALDER A C,KOLLER T,et al.Identification of fluoroquinolone antibiotics as the main source of human genotoxicity in native hospital wastewater[J].Environmental Toxicology and Chemistry,1998,17(3):377-382.

[8] SANDERSON H,JOHNSON D J,WILSON C J,et al.Probabilistic hazard assessment of environmentally occurring pharmaceuticals toxicity to fish,daphnids and algae by ECOSAR screening[J].Toxicology Letters,2003,144(3):383-395.

[9] 徐冬梅，王艳花，饶桂维.四环素类抗生素对淡水绿藻的毒性作用[J].环境科学,2013,34(9):3386-3390.

[10] 鲍艳宇，周启星，谢秀杰.四环素类抗生素对小麦种子芽与根伸长的影响[J].中国环境科学,2008,28(6)：566-570.

[11] 林琳，安婧，周启星.土壤四环素污染对小白菜幼苗生长发育的生态毒性[J].环境科学,2011,32(8):2430-2434.

[12] BRADEL B G,PREIL W,JESKE H.Remission of the free-branching pattern ofEuphorbiapulcherrimaby tetracycline treatment[J].Journal of Phytopathology,2000,148(11/12):587- 590.

[13] PERSOONE G,DIVE D.Toxicity tests on ciliates - a short review[J].Ecotoxicology Environmental Safety,1978,2(2):105-114.

[14] 史新柏.棘尾虫[J].生物学通报，2001,36(2):1-3.

[15] 焦迪.草履虫毒性实验的研究进展[J].哈尔滨师范大学自然科学学报，2012,28(3):64-67.

[16] 韩志泉.太阳虫、钟虫和喇叭虫[J].生物学通报，1994,29(1):26-27.

[17] WOLLENBERGER L,HALLING SORENSEN B,KUSK K O.Acute and chronic toxicity of veterinary antibiotics toDaphniamagna[J].Chemosphere,2000,40(7):723-730.

[18] 王慧珠,罗义,徐文青，等.四环素和金霉素对水生生物的生态毒性效应[J].农业环境科学学报,2008,27(4):1536-1539.

[19] 于振洋，张晶，张洪昌，等.盐酸四环素对秀丽线虫(C.elegans)的急性与多代毒性研究[J].生态毒理学报,2010,5(3)：320-326.

Comparativestudyonacutetoxicityoftetracyclineandtetracyclinehydrochloridetothreeciliates

ZHAOYe，ZHANGChenji，DINGShuang，CAIXinglong，PANXuming，CHENYing.

(CollegeofLifeScienceandTechnology，HarbinNormalUniversity，HarbinHeilongjiang150025)

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.07.005

2017-01-08)

赵 也，女，1990年生，硕士研究生，主要从事原生动物生理生态学研究。#

。

*国家自然科学基金资助项目(No.31471950)；黑龙江省博士后资助项目。