玉米生物活性肽膜提纯工艺技术研究

陆启明，陈志成

河南工业大学 (郑州 450001)

2017-07-07

国家自然科学基金项目(项目编号：31171789)。

陆启明，男，1972年出生，工程师，研究方向为农产品深加工。

*通讯作者：陈志成，男，1960年出生，教授，硕士生导师，研究方向为谷物资源与综合利用和粮食加工工程。

玉米生物活性肽膜提纯工艺技术研究

陆启明，陈志成*

河南工业大学 (郑州 450001)

玉米蛋白粉在一定的温度、pH、底物浓度的条件下，经碱性蛋白酶水解后得到含有玉米低聚肽的混合液体，其中含有分子量大于1 280 Da的肽、蛋白及分子量小于260 Da的肽、氨基酸、各种离子，影响了低聚肽的纯度。采用透过分子量10 000 Da的超滤膜除去大分子物质，采用透过分子量1 000 Da的钠滤膜去除小分子物质及各种离子，得到分子量在260～1 280 Da的低聚肽，其液体含量在80%以上；该液体经浓缩至30%～35%，进行离心喷雾干燥，得到水分小于6%且低聚肽含量在80%以上的低聚肽粉。

玉米生物活性肽；超滤膜；钠滤膜；提纯

玉米生物活性肽是玉米蛋白粉在一定条件下的水解产物，在此水解液中有大量的没被水解的玉米蛋白，不同分子量的低聚肽，氨基酸及盐离子等混合物。如何从该液体中得到纯度较高的低聚肽粉是玉米生物活性肽生产的关键环节，本文对经过板滤除去蛋白等大分子物质后的液体，用超滤技术对于大分子有机物、悬浮固体等的分离，再用纳滤技术对小分子、无机盐进行有效的脱除，可以得到低聚肽含量大于80%的玉米生物活性肽液体，利用该提纯后的液体可生产符合轻工行业标准QB/T 4707—2014的低聚肽粉，情况如下。

1 材料与方法

1.1材料

60目玉米蛋白粉，郸城财鑫糖业有限责任公司提供，执行标准Q/DCT-0001S—2006。

由于本工艺生产的玉米生物活性肽为食品原料，在生产质量方面，所有的原辅料必须都是食品级，才能进行产业化生产，而目前玉米蛋白粉执行标准是农业部制订的饲料用标准，由此在本课题开始研究时，郸城财鑫糖业有限责任公司特制定了原料玉米蛋白粉的企业标准，并在河南省卫生厅备案，执行标准Q/DCT-0001S—2006。具体控制指标见表1～表3。

表1 感官指标

表2 理化指标

表3 微生物指标

真菌毒素是影响食品安全的主要问题，本文研究所用的玉米蛋白粉应符合GB 2761的规定，并对玉米蛋白粉生产所用的原料玉米和原料玉米蛋白粉进行的毒素监测，生产过程卫生指标控制符合要求，又是在封闭的无菌环境，确保本课题研究的原料玉米蛋白粉是安全的。具体官方检测结果如下表4、表5所示。

表4 玉米毒素检测结果

表5 玉米蛋白粉毒素检测结果

1.2辅料与设备

碱性蛋白酶(食品级、诺维信)、NaOH(分析纯)、HCl(分析纯)、高压灭菌锅(上海博讯)、纳滤膜设备(厦门赛普特)、刮板式真空蒸发器(无锡志邦)、喷雾干燥塔(无锡东升)。

1.3方法

1.3.1多肽生产工艺流程

玉米蛋白粉→预处理→碱性蛋白酶水解→灭酶→除渣过滤→超滤截留→纳虑除盐→真空浓缩→灭菌→喷雾干燥→生物活性肽

1.3.2生产工艺流程介绍

1.3.2.1 玉米蛋白粉的预处理

蒸煮处理方法：原料玉米蛋白粉按1∶5加水配料，加热至121 ℃维持30 min，冷却后调整pH值至5.0过滤，除去过滤液后按原料质量的10倍加水进行水解。

1.3.2.2 玉米蛋白粉的酶解

酶解操作，将一定质量的玉米蛋白粉溶液置于酶解罐中；用NaOH调pH值为9.0；按[E]=0.5 μ/mL的比例加入一定量的碱性蛋白酶；升温至45 ℃开始水解，水解反应时间2 h；酶解反应结束，调整pH值4.5～5.0，加热进行灭酶，然后除渣过滤，滤液待用。

1.3.2.3 水解液的除渣过滤

将水解液用隔膜泵打入板框过滤机，得到含有多肽的水解滤液；打开板框过滤机将滤渣取出，收集并处理；将过滤后的水解液先经过保安滤芯进一步除去杂质。

1.3.2.4 超滤截留和钠滤除盐

超滤技术一般用于大分子有机物、悬浮固体等的分离，截留的分子量在1 000～300 000。超滤膜是一种孔径范围为0.001～0.020 μm的微孔过滤膜，且孔径规格一致[1]。在膜的料液面加压之后，小于孔径的溶质分子就会慢慢脱离滤膜而渗透出来，而分子量大于500 Da(原子质量单位)、粒径大于10 nm的颗粒就会被截留在膜的表面，以此达到分离的效果[2]。

纳滤则是能对小分子有机物与水、无机盐进行分离的技术，截留分子量范围在150～1 000，截留率范围在60%～90%，而其截留特性是以对标准NaCl、MgSO4、CaCl2溶液的截留率来表征，因此纳滤能同时实现浓缩和脱盐两方面的作用[3]。

本工艺采用截留分子量10 000 Da超滤膜及截留分子量1 000 Da的钠滤膜进行多肽液体的提纯实验研究，进而得到低聚肽含量大于80%的多肽液体。

1.3.2.5 浓缩、喷雾干燥

浓缩后进行高温灭菌，利用离心喷雾塔，通过调整转速、进出口温度来控制肽粉的颗粒大小和水分要求。

2 结果与讨论

2.1玉米蛋白粉的酶解液的膜分离提纯收率及产品收率

按照投1批200 kg玉米蛋白粉计，多肽生产各工序物料测量计算具体见图1。

图1 玉米生物多肽生产工艺流程图

由图1所示，经板框过滤后得到1 942 kg(浓度6%、干物含量116.5 kg)的多肽液体，经超滤后得到1 742 kg(浓度5.86%，干物含量102 kg)的透过液，干物收率为87.55%；该液体再经钠滤膜除盐及小分子物质后，得到钠滤膜截留液380 kg(浓度13%、干物含量49.4 kg)，干物收率48.4%。该工艺最终产品对投入玉米蛋白粉的收率为50.4/200×100%=25.2%。

2.2玉米生物多肽质量标准及提纯产品质量

2.2.1玉米生物多肽质量标准

质量标准参考中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4707—2014。

2.2.2超滤膜截留肽分子量分布的测定

2.2.2.1 蛋白水解物中肽分子量分布的测定

对于蛋白水解物中肽的分子量分布一般采用凝胶色谱的方法来进行测定。用高分离度凝胶色谱预装柱Superdex Peptide 10/300 GL(10×300-310 mm)在purifier 100上进行测定。

2.2.2.2 绘制凝胶层析标准蛋白分子量曲线

图2 标准分子量蛋白的凝胶过滤洗脱曲线

在凝胶色谱中使用以下标准蛋白质分子量：还原型谷光甘肽(307.32 Da)；氧化型谷光甘肽(612.63 Da)；杆菌肽(1 422.69 Da)；Aprotinine(6 511.51 Da)；蓝色萄聚糖2000(2 000 kDa)。蓝色萄聚糖2000也可以用来测定色谱柱外水体积V0[4]。

在采用凝胶色谱进行过滤时，洗脱液采用20 mmol/L、pH值为7.0的磷酸-磷酸盐缓冲液，取100 μL的样品进行上样，流速控制在0.25 mL/min，以214 nm为检测波长，测定蓝色萄聚糖2 000和各分子量标准蛋白的洗脱体积Ve[4]。标准蛋白的洗脱图谱见图2。

2.2.2.3 玉米蛋白粉酶解液中肽分子量分布的测定

将样品的凝胶层析谱图与标准蛋白凝胶层析谱图进行比对，计算蛋白水解物中肽的分子量分布情况。

2.2.2.4 超滤膜透析液的肽分子量分布

与标准白凝胶层析谱图进行对比，通过不同截留分子量的超滤膜，计算出水解物中肽的分子量分布，根据肽的分子量分布结合寡肽的分子量大小，选用适合的超滤膜进行截留。本文以截留10 000分子量的中空纤维超滤膜为例说明水解液中肽分子量分布的情况，如表6所示。

表6 10 000膜透析液分子量分布情况

根据标准蛋白洗脱曲线，可以计算出过10 000膜透析液的肽段中分子量大于1 212.060的占肽段总量的20.38%，分子量在1 212.060～256.631的占肽段总量的71.62%，分子量小于256.631的占肽段总量的8.0%。

2.2.3纳滤膜截留分子量的选定

2.2.3.1 纳滤膜截留分子量对除盐效果及低聚肽收率的影响

电导率与TDS的关系：电导率和溶解固体量浓度的关系近似表示为：1.4 μS/cm=1 ppm或2 μS/cm=1 ppm[5]，其中，1 ppm等于1 mg/L。水中所有离子的总含量可以用TDS用来衡量，因此，电导率也可用来间接表征TDS，一般以ppm表示。溶液中各种离子电导率相加即可得到溶液的电导率，比如：纯食盐溶液：Cond.=Cond (purec water)+Cond(NaCl)或者Cond.=0.055+Cond(NaCl)

电导率和TDS的关系并不呈线性，但在有限的浓度区段内，可采用线性公式表示：例如100 μS/cm×0.5 (as NaCl) = 50 ppm TDS(μS：微西门子)食盐的TDS-电导率换算系数为0.5。所以：是将溶液的电导率折半约等于TDS(ppm)。

2.2.3.2 纳滤膜脱盐率的计算

纳滤膜脱盐率=产水TDS/进水TDS×100%

低聚肽收率=V0×C0/V×1×C1

式中：C0，水解液中可溶性蛋白含量；V0，水解液体积；V1，过滤液中可溶性蛋白含量；C1，过滤液体积。

表7 不同截留分子量纳滤膜的除盐效果及低聚肽收率

由表7可以看出纳滤膜截留分子量越大，脱盐效率越高但是低聚肽收率液越低，因此需选用合适的纳滤膜对水解液进行脱盐处理，由纳滤膜试验结果可知选用800～1 000截留分子量的纳滤膜进行除盐，可在保证低聚肽收率90%以上的情况下，除去水解液中90%以上的盐分，综合考虑纳滤膜过滤效率问题生产采用截留分子量1 000 Da的纳滤膜进行处理多肽超滤膜的透析液。

2.2.3.3 玉米生物多肽提纯质量情况

本文把截留分子量1 000 Da的纳滤膜浓缩液进行分子量分布分析，截留分子量1 000 Da的纳滤膜浓缩液分子量分布图谱如图3。

图3 纳滤膜浓缩液分子量分布图谱

根据标准蛋白洗脱曲线，可以计算出过1 000膜浓缩液的肽段中分子量大于1 282.931的占肽段总量的10.48%，分子量在1 282.93～260.696的占肽段总量的81.50%，分子量小于260.696的占肽段总量的8.02%。

3 结束语

玉米蛋白粉的酶解液经板滤过滤后，先经10 000的超滤膜截留大分子物质后，然后再经截留分子量1 000 Da的纳滤膜除去水解液中的小分子氨基酸和盐类，进行提纯处理，可保证了低聚肽的收率，超滤工序收率达87.55%，钠滤工序收率达48.4%，产品对原料收率达25.2%。过滤液经真空浓缩、灭菌、喷雾干燥得到粉状活性肽，经分析检验可溶性多肽含量大于80%、灰分小于5%，符合玉米低聚肽粉中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4707—2014的要求。通过实验验证玉米生物活性肽膜提纯工艺是可行的。

[1] 柯 洪. 试论超滤膜技术处理屋面雨水[J].科技信息, 2012(24): 416-417.

[2] 马爱平. “膜法”技术施魔法农民喝上安康水[J]. 中国农村科技, 2014(3): 23-25.

[3] 刘义磊. 矿井回风流中瓦斯回收利用技术研究[D].济南: 山东科技大学, 2011.

[4] 张 铁. 玉米黄粉谷蛋白的提取、酶解及物性研究[D].齐齐哈尔: 齐齐哈尔大学,2012.

[5] 张 超. 浅谈化学仪表的应用[J].化学工程与装备, 2011(2): 132-134.

Studyonmembranepurificationtechnologyofcornbioactivepeptide

Lu Qiming, Chen Zhicheng*

Henan University of Technology (Zhengzhou 450001)

The corn protein powder, under the condition of certain temperature, Ph, substrate concentration, can get mixed liquid of corn oligopeptide by alkaline protease hydrolysis, which contains the peptide and protein, with molecular weight > 1 280 Da, and contains the peptide, amino acid, various ion with molecular weight < 260 Da, which affects the purity of oligopeptide. The ultrafiltration membrane through 10 000 Da molecular weight was used to remove macromolecules material and the ultrafiltration membrane through 1 000 Da molecular weight was used to remove micromolecule material and various ion, then the oligopeptide is get with molecular weight 260～1 280 Da, and its liquid content > 80%; the liquid is concentrated to 30%～35%, dried by centrifugal spray, the oligopeptide powder is obtained with liquid content < 6% and oligopeptide content > 80%.

corn bioactive peptide; ultrafiltration membrane; nano filtration membranes； purification

TS201

A

1672-5026(2017)05-041-05