芝麻香型机械化和手工工艺酒醅发酵过程中的糖与糖苷

江流，范文来，徐岩

(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学 生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡， 214122)

芝麻香型机械化和手工工艺酒醅发酵过程中的糖与糖苷

江流，范文来*，徐岩

(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学 生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡， 214122)

采用六甲基二硅氮烷(HMDS)作为衍生剂，结合气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry ，GC-MS)技术研究了机械化和手工工艺酒醅中的糖类化合物(糖、糖苷和糖醇)在发酵过程中的变化。研究结果表明，酒醅发酵过程中，糖总量呈下降趋势，糖醇总含量呈上升趋势，糖苷呈现先上升再下降趋势。手工酒醅中葡萄糖、糖苷、糖醇含量均明显高于机械化酒醅，但机械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅高；2种工艺酒醅中的二糖含量差异不明显。

酒醅；糖醇；糖；糖苷；硅烷化；气相色谱-质谱(GC-MS)；发酵

白酒酒醅发酵过程中，原料淀粉被微生物分解为葡萄糖等糖类，还原糖进一步被微生物转化为各种小分子物质，这些小分子物质在常温、长期发酵时发生各种化学反应(如糖与氨基酸的反应)，产生风味物质。糖是微生物的重要碳源，能影响微生物的生长、繁殖[1]。

目前我国酒醅中糖的研究主要集中在还原糖[2-3]和总糖[4]方面，较少涉及糖及糖醇的研究，未见糖苷研究的报道。唐洁[5]曾利用高效液相色谱法(HPLC)测定了清香型酒醅发酵过程中葡萄糖的变化；2015年孙洁等人[6]应用离子色谱方法测定了酒醅中的赤藓糖醇、木糖醇、葡萄糖等10种糖和糖醇；而被大量研究的国外饮料酒发酵过程中的糖苷，则未见在我国白酒酒醅中的进行过相关报道。

测定糖类物质(糖、糖醇、糖苷)的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[7]、毛细管电泳法(CE)[8]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[9]、离子色谱法[6]等。硅烷化衍生结合GC-MS法是检测多羟基化合物的常用方法[9-11]，常见硅烷化试剂有六甲基二硅氮烷(HMDS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、N-(特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)等。硅烷化HMDS因其与糖反应时间短，响应较好，在葡萄酒研究中获得广泛应用[10]。

本研究以芝麻香型机械化和手工2种不同工艺的酒醅为研究对象，采用HMDS衍生化结合GC-MS方法对糖、糖醇、糖苷进行定性、定量分析，分析酒醅发酵过程中糖、糖醇和糖苷的变化，以便于更进一步研究发酵过程中微生物及其代谢情况。

1 材料和方法

1.1材料和仪器

芝麻香型酒醅由山东某酒厂提供，机械化酒醅发酵期49 d，手工酒醅发酵期52 d，堆积结束取1次样，发酵前5天每天取1次样，之后每隔5天取1次样，直至发酵结束。

试剂:阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、松二糖、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、甘油、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、水杨苷(内标，IS)、吡啶、三氟乙酸(TFA，色谱纯)、HMDS(衍生剂，色谱纯)，Sigma-Aldrich(上海)公司；0.22 μm 微孔滤膜(有机相)，上海泰坦科技。

仪器:Thermo Scientific GC TSQ8000-MSD Trace 1310，美国Thermo Fisher公司；N-EVAP 氮吹仪，美国Organomation公司；超纯水仪，美国Millipore公司。

1.2实验方法

1.2.1 糖类提取

使用改进的PARTRICIA等[12]方法。取5.0 g酒醅于50 mL离心管中，加入25 mL超纯水，振荡均匀后，置于4 ℃冰箱中过夜，冰浴超声15 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，收集在25 mL容量瓶中，最后用超纯水定容至25 mL，置于-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 HDMS衍生化

参考FRANCIS[13]的方法。取100 μL上述萃取液于2 mL样品瓶中，加入100 μL 内标水杨苷，终含量为220 mg/L，轻轻振荡摇匀，缓慢氮气吹干。吹干后，加入100 μL吡啶、100 μL HMDS和10μL TFA，振荡摇匀后，于45 ℃条件下反应30 min，冷却至室温再进行GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS条件

根据石亚林等[14]的方法。取反应后的样品进行GC-MS分析，进样量为1 μL。GC条件：色谱柱为TG-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，进样口温度为280 ℃; 载气为氦气，流速1. 3 mL/min，分流比为20∶1;升温程序为:65 ℃保持2 min，以6 ℃/min 升温至280 ℃，并保持15 min。MS 条件:EI 电离源，电子能量70 eV，扫描范围:50～650 amu，离子源温度:300 ℃。

测定结果与NIST08质谱库进行比对，通过特征离子、保留时间、匹配度进行初步鉴定，再用标准物质进行最终确认。没有标准品的化合物为临时性鉴定的化合物。

1.2.4 定量分析

糖类物质定量使用选择离子模式(SIM)，绘制标准曲线：用煮沸过的超纯水配制待测物质的混合标准溶液，各物质的最初含量为阿拉伯糖637 mg/L、木糖1 483 mg/L、葡萄糖2 394 mg/L、松二糖318 mg/L、海藻糖1 413 mg/L、赤藓糖醇 916 mg/L、木糖醇 1 090 mg/L、阿拉伯糖醇1 029 mg/L、核糖醇 635 mg/L、半乳糖醇 823 mg/L、甘露糖醇 1 001 mg/L、山梨糖醇 804 mg/L、肌醇523 mg/L、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷1 297 mg/L，然后将混合标准溶液梯度稀释(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/1 024)，各梯度溶液与样品处理方式、反应条件和测定条件完全相同。以糖类物质与内标的含量比作为纵坐标，糖类物质峰面积与内标物质的峰面积比作为横坐标绘制标准曲线。检测限(LOD)：仪器信噪比为 3时可检测到的化合物的质量含量；定量限(LOQ)：取10倍信噪比。

2 结果与讨论

2.1酒醅中糖类物质定性和定量

本研究采用HMDS衍生化结合GC-MS方法对酒醅中的糖类物质进行了分析检测，共定性了5种糖、8种糖醇和2种糖苷(1种是临时性鉴定)，其中葡萄糖、赤藓糖醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、阿拉伯糖醇已有文献报道[6]，阿拉伯糖、木糖、松二糖、海藻糖、核糖醇、肌醇、甲基-α-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(临时性鉴定)等8种化合物是首次在酒醅中检测到。甘油葡萄糖苷已经在日本清酒中鉴定出[15]。由于没有标准品，故采用其峰面积与内标峰面积比来计算其含量(半定量)。

因吡喃和呋喃环上的—OH 存在1α-和1β-立体异构，故单糖和甲基-α-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(临时性鉴定)有2个色谱峰，计算峰面积时将2个色谱峰的面积相加[12]。

1-赤藓糖醇；2，2*-阿拉伯糖；3，3*-核糖；4，4*-木糖；5-木糖醇；6-阿拉伯糖醇；7-核糖醇；8，8*-甲基-α-吡喃葡萄糖苷；9，9*-葡萄糖；10-甘露糖醇；11-山梨糖醇；12-半乳糖醇；13-肌醇；14，14*-甘油葡萄糖苷；IS-内标；15-松二糖；16-海藻糖图1 酒醅中糖类物质衍生化后总离子流图(TIC)Fig.1 GC-MS total ion current of silylated carbohydrates in fermented grains

从表1可以看出，所有待测定化合物标准曲线R2在0.986～0.999之间，线性较好；相对标准偏差(RSD)在2%～7%之间；回收率在89%～104%之间，该法能够定量酒醅中的糖类物质。

2.2发酵过程中糖类物质变化

2.2.1 发酵过程中糖和糖苷变化

无论是手工工艺还是机械化工艺，随着发酵进行糖总含量呈下降趋势，酒醅中糖最高含量为11.80 mg/g(湿重，下同)，发酵结束时仅有1.18 mg/g(见图2和图3)。酒醅发酵初期，原料中淀粉经糖化酶作用产生葡萄糖等还原糖。第1天，葡萄糖含量最高，达9.38 mg/g，低于文献报道值27.65 mg/g[6]；后葡萄糖含量开始下降，其他糖具有类似变化。含量第2高的糖是阿拉伯糖，在整个发酵过程中最高达1.18 mg/g；含量较高的糖还有木糖和核糖，最高含量分别为0.57 mg/g和0.59 mg/g。

表1 糖类物质的定量离子、标准曲线、R2、LOD、LOQ、回收率、RSD(n=3)和线性范围

图2 机械化酒醅发酵过程中游离态单糖的变化Fig.2 Concentrations of free monosaccharides during fermentation of grains by mechanical production

图3 手工酒醅发酵过程中游离态单糖的变化Fig.3 Concentrations of free monosaccharides during fermentation of grains by traditional production

首次检测到的2种二糖即海藻糖和松二糖含量较低，最高含量分别为0.39 mg/g和0.20 mg/g，且发酵前后变化不明显(图4和图5)。海藻糖是原料中淀粉水解产物[16]，也是某些酵母菌抵抗不良环境的应激代谢产物[17]。松二糖是蔗糖的同分异构体，在某些酶存在的条件下，蔗糖可转化为松二糖[18]。

图4 机械化酒醅发酵过程中二糖和糖苷的变化Fig.4 Concentrations of free disaccharides and glucoside during fermentation of grains by mechanical production

图5 手工酒醅发酵过程中二糖和糖苷的变化Fig.5 Concentrations of free disaccharides and glucoside during fermentation of grains by traditional production

首次鉴定出的2个糖苷甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷(临时性鉴定)在2种工艺酒醅发酵过程中变化基本一致，总体呈下降趋势(图4和图5)。手工酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷最高含量均比机械化中最高含量高，分别比机械化酒醅中含量高78.50%和139.69%，甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷含量于第20天达到最大值，为0.83 mg/g；甘油葡萄糖苷第10天达到最高，为1.16 mg/g。

2.2.2 发酵过程中糖醇变化

不论是何种工艺，糖醇在酒醅发酵过程中的含量总体呈上升趋势(见图6和图7)。机械化酒醅中糖醇总量在发酵第45天最高，达8.07 mg/g，手工酒醅糖醇总量发酵结束时，即第52天达到最高，为7.80 mg/g。酒醅中含量最高的糖醇为赤藓糖醇，最高含量达2.08 mg/g，与文献报道值类似[6]。其次为木糖醇、核糖醇和阿拉伯糖醇，最高含量依次为1.83 mg/g、1.66 mg/g和1.61 mg/g。从图6和图7可以看出，木糖醇和阿拉伯糖醇同步变化。木糖醇和阿拉伯糖醇含量都低于文献报道芝麻香型酒醅中的含量(分别为4.31 mg/g和5.67 mg/g)[6]。

图6 机械化酒醅发酵过程中游离态糖醇的变化Fig.6 Concentrations of free alditols during fermentation of grains by mechanical production

图7 手工酒醅发酵过程中游离态糖醇的变化Fig.7 Concentrations of free alditols during fermentation of grains by traditional production

2.2.3 两种工艺酒醅中糖类物质比较

无论何种工艺，酒醅发酵过程中糖含量总体呈下降趋势。比较2种工艺中糖类物质，其变化存在差异。机械化和手工酒醅中葡萄糖在第1天同时达到最高值，但机械化酒醅中含量更高，比手工酒醅高30.78%。机械化酒醅中阿拉伯糖含量在第5天达到最高值(1.18 mg/g)，而手工酒醅第15天达到最高值(1.15 mg/g)。发酵结束时，手工酒醅中葡萄糖含量比机械化酒醅高4.62%；但机械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅中高24.57%。

二糖在发酵过程总体呈下降趋势(图4和图5)。发酵过程中，2种工艺酒醅中松二糖含量差异较小。第0～4天，2种工艺酒醅中海藻糖含量均先上升后下降再上升，机械化中海藻糖含量第2天达到最高值(0.46 mg/g)，相比第0天上升了76.50%，而手工酒醅中第1天达到最高值(0.38 mg/g)，相比第0天上升了4.63%。第4天之后，2种工艺中海藻糖含量都下降，机械化中下降得较快。发酵结束时2种工艺酒醅中海藻糖含量差异不大。

2种工艺中糖苷变化趋势一致，总体而言，手工酒醅中含量高于机械化酒醅。第0～5天，2种工艺中糖苷变化较小，第5～10天大幅上升，且手工酒醅中上升得更快；之后则逐渐下降。机械化酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷含量在第10天达到最高值0.46 mg/g，而手工酒醅第20天达最高值0.83 mg/g。2种工艺中甘油葡萄糖苷含量都在第10天达到最高，机械化和手工酒醅中分别为0.48 mg/g和1.16 mg/g。发酵结束时，手工酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷含量均高于机械化酒醅，前者高57.79%，后者高172.10%(图4和图5)。理论上讲，糖苷在酸性的酒醅中应该处于水解状态，但本研究却发现在酒醅发酵前10天处于上升趋势，是反应产生的，还是其他原因造成的，值得深入研究。

手工生产时酒醅中糖醇含量较高。发酵前后，机械化酒醅中糖醇总含量上升了53.86%，而手工酒醅中糖醇总含量上升了84.97%，机械化酒醅中赤藓糖醇在第35天达到最高2.08 mg/g，而手工酒醅在第40天达最高值1.97 mg/g。发酵结束时，手工酒醅中赤藓糖醇含量比机械化酒醅高31.55%；此外，发酵结束时，手工酒醅中木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇含量分别比机械化酒醅中高11.82%、59.58%和26.33%。

3 结论

本研究定性定量了芝麻香型酒醅发酵过程中的糖类物质，首次在酒醅中检测到阿拉伯糖、木糖、松二糖、海藻糖、核糖醇、肌醇、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(临时性鉴定)。发酵过程中糖总体呈下降趋势，而糖醇总体呈现上升趋势，至发酵结束时，呈下降趋势。甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷(临时性鉴定)是先上升，到第10天后再缓慢下降，且手工酒醅发酵过程中糖苷含量明显高于机械化酒醅。至发酵结束时，手工酒醅中葡萄糖含量比机械化酒醅高，但机械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅高；发酵结束时2种工艺酒醅中二糖含量差异不明显；与机械化酒醅相比，手工酒醅中含有更多的糖苷、糖醇。

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CarbohydratesandglucosidesfromfermentedgrainsduringmechanicalandtraditionalproductioninChineseroasted-sesame-likearomatypeliquor

JIANG Liu,FAN Wen-lai*,XU Yan

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Free soluble carbohydrates and glucosides in fermented grains during mechanical and traditional production were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) as their trimethylsilyl derivatives using hexamethyldisilazane (HMDS). The results suggested that the total content of sugar decreased and the total content of glucosides increased before reduction. The total content of alditols increased. The content of glucose, glucosides and altitols in fermented grains by traditional production was higher than that of fermented grains by mechanical production, but the content of arabinose was lower. There was no significant difference in the content of disaccharides between these two kinds of fermented grains.

fermentedgrains；alditols；sugars；glucosides；silylation；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；fermentation

硕士研究生(范文来研究员为通讯作者，E-mail：wenlai.fan@163.com)。

国家重点研发计划(National Key R&D Program,2016YFD0400503)；国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA102108)

2017-03-31，改回日期：2017-04-21

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014421