绿茶饮料污染菌人参土芽孢杆菌的鉴定和分析

吴阿宝，黄庭轩,杨祖顺，高雯，周帼萍*

1(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉,430023) 2(云南省疾病预防控制中心，云南 昆明，650022)

绿茶饮料污染菌人参土芽孢杆菌的鉴定和分析

吴阿宝1，黄庭轩1,杨祖顺2，高雯1，周帼萍1*

1(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉,430023) 2(云南省疾病预防控制中心，云南 昆明，650022)

分析了某批绿茶饮料出现颜色变浅，出现少量片状沉淀的变质原因。首先采用平板计数琼脂、橙血清和乳酸菌培养基分离和计数污染菌，该菌在原料——茶叶和糖中有检出，原位清洗(Clean In Place，CIP)后能在管道中检出。16S rRNA序列分析鉴定其主要污染菌最接近脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)和人参土芽孢杆菌(Bacillusginsengihumi)。但是从生理生化特性来看，该污染菌生长pH范围4.68～7.30，最适pH4.68，生长温度范围为15～45 ℃，最适生长温度为40 ℃，不符合脂环酸芽孢杆菌属耐酸耐热特性。综合16S rRNA序列分析和生理生化特性，该菌被鉴定为人参土芽孢杆菌。成品中的污染来自原料，因萃茶和灌装管路的CIP系统未分开，而该菌能耐受原位清洗的酸洗、碱洗和热水洗，通过灌装线污染成品。人参土芽孢杆菌首次被发现是一种低酸性饮料——绿茶饮料的污染菌，该菌对CIP清洗有很好耐受性，导致成品灌装线的污染。

绿茶饮料；变质；人参土芽孢杆菌；脂环酸芽孢杆菌

绿茶在我国有着悠久的历史，深受国人喜爱，近20年来在此基础上研究开发的绿茶饮料种类繁多。其中茶多酚具有一定抑菌作用[1]，但是pH近中性加上国内消费者喜甜，多数绿茶饮料中加了少量的糖，并且为了保持营养和色泽，杀菌参数不能过高只需要达到商业无菌要求即可，所以少量来自原料——茶叶和糖的耐热芽孢杆菌能存活，并在合适条件下甚至可能导致绿茶饮料变质[2]。

2006年首次报道的1株人参土芽孢杆菌(Bacillusginsengihumi)Gsoil 114T是从韩国人参种植园土壤中分离的革兰氏阳性、需氧或兼性厌氧芽孢杆菌。该菌在营养琼脂上生长良好，能利用部分碳水化合物作为单一碳源，如D-木糖，但不能利用L型氨基酸和有机酸,氧化酶阳性,触酶阴性,不能降解生物大分子如淀粉、纤维素、木聚糖、酪蛋白、壳多糖和DNA[3]。之后关于该菌报道比较少，2013年在陕西省中部2份猕猴桃果园土壤中曾检出2株人参土芽孢杆菌(认为是嗜酸耐热菌之一)[4]，直到2013年发现该菌具有高植酸酶酶活，具有良好的应用前景[5]，2015年对该菌株进行了全基因组测序[6]和异源表达[7～8]。同年在加工后的南美传统饮料马黛茶的耐热菌中也检出了人参土芽孢杆菌[9]。通过PCR-DGGE方法发现该菌在脱油麻风树生物发酵产氢[10]和硫酸盐废水处理加乙酸做碳源时是发酵菌群中的优势菌[11]。

2015年底某企业生产的绿茶样品中出现异常样品，正常样品pH值为6.5～6.6，异常品下降到4.8左右，明显变酸，起初样品除了颜色变浅外没有其他变质特征，不混浊不产气，到后期才出现少量片状沉淀物。本研究分析这起持续性绿茶饮料污染事件的污染菌是人参土芽孢杆菌，该菌具有耐受工业CIP(clean in place，原位清洗)的特性，值得业界关注。

1 材料与方法

1.1样品与标准株

正常和变质绿茶成品、原料(茶叶、糖和瓶盖)、各工段包括CIP和SIP(sanitize in place，原位消毒)前后等样品均由企业提供。

标准株酸土脂环芽孢杆菌ATCC49025(购自中国工业微生物菌种保藏中心CICC)。

1.2材料与试剂

平板计数琼脂(plate count agar，PCA)、乳酸细菌培养基(man rogosa sharpe medium,MRS)，北京陆桥公司；橙血清琼脂培养基(orange serum agar,OSA)，英国OXOID公司；麦芽汁琼脂(malt extract agar,MEA)、BAT琼脂(BAT Agar)脂环芽孢杆菌培养基，美国MERCK公司；YSG培养基(yeast starch glucose,YSG)、LB培养基(Luria-Bertani,LB)及1 mol/L柠檬酸自制。VITEK 2COMPACT鉴定所需试剂和测试卡，法国梅里埃公司；Premix Taq、DL2000 DNA Marker、核酸染料Goldview ，日本TaKaRa公司；琼脂糖，西班牙Biowest公司；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)引物合成和产物测序，苏州金唯智科技有限公司。

1.3主要仪器设备

VITEK 2COMPACT全自动细菌鉴定和药敏分析仪，法国梅里埃公司；80i正置荧光相差显微镜(YS100)，日本Nikon公司；PHS-25酸度计，上海雷磁；FP-1100-C型全自动生长曲线分析仪，芬兰Bioscreen公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州智博睿。

1.4实验方法

1.4.1 微生物的检测

企业前期检测已明确是细菌污染，所以参照《GB 4789.2—2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[12]，样品振荡均匀、梯度稀释，分别在PCA/MRS/OSA/3种平板上浇混或涂布，37 ℃培养2 d后计数。菌落划线分纯观察单菌落，革兰氏染色观察显微形态。

1.4.2 分离株的16S rDNA序列分析

菌裂解液的制备、通用引物(27F和804R或1492R)、加样体系和PCR程序参见文献[13-14]，产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，Goldenview染色，凝胶成像分析仪观察PCR扩增结果，产物送往苏州金维智公司测序。序列比对：在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行BLASTN比对，采用MEGA(Ver.6.06)软件构建邻近(neighbor-joining，NJ)法系统进化树。

1.4.3 VITEK 2COMPACT生化测试和鉴定

挑取OSA培养基上37 ℃培养24 h的少量菌苔用VITEK 2COMPACT全自动细菌鉴定和药敏分析仪进行生理生化测试。

1.4.4 生长温度范围的检测

用OSA培养基活化菌株，转入LB培养基液37 ℃ 140 r/min摇床18 h制备种子液，1%(v/v)接种至LB培养液中于15、20、25、28、37、35、40、45、55、(60±1) ℃水浴培养3 d和空白对照比较观察细菌生长(主要观察混浊度)。

1.4.5 pH值生长范围的检测

采用1 mol/L柠檬酸调液体LB培养基的pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)并灭菌，同1.4.4制备种子液接种(1%v/v)静置培养3 d观察，初步确定该菌生长pH范围在pH 4.0～7.0。进而设置pH的梯度为0.2(即pH 4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0)，每个pH条件下的LB培养液均设置1个空白，测灭菌后实际pH值(pH 4.02、4.25、4.45、4.68、5.15、5.22、5.50、5.71、5.90、6.05、6.25、6.57、6.98、7.03、7.30、7.42、7.95)，每组3个重复，接种量5%(v/v)；用芬兰Bioscreen全自动生长曲线分析仪绘制不同pH条件下连续培养48 h的生长曲线。

1.4.6 耐盐度测试

制备NaCl含量为0.0%、6.5%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%、16.0%、18.0%、20.0%的pH5.22的LB培养液，灭菌后接种子液(参见1.4.4)1%(v/v)，37 ℃培养48～72 h，对比空白对照观察生长情况。

2 实验结果

2.1分离培养基的比较

采用3种不同分离培养基(OSA/MEA/PCA)对2个绿茶饮料成品样进行检测，37 ℃培养24～48 h发现2份成品的污染菌在3种培养基上菌落形态单一且相似，可判断只有一种污染菌。该菌在PCA平板上生长迟缓(需48 h)，数量少，PCA平板不适合该细菌的分离培养；在MEA和OSA平板上生长快(24 h)数量多，两者均适合做分离培养基(见表1)。在MEA平板上为小圆形菌落(4～6 mm)，润泽，边缘平整，半透明，颜色与培养基相近，偏黄；在OSA平板上和在MEA平板上的菌落基本一致，在OSA上颜色稍浅。

表1 分离培养基的比较

注:*因菌落蔓延成片为估算值。

2.2分离株显微形态观察

对培养48～72 h的分离株Y3进行革兰氏染色，革兰氏阳性菌(G+)芽孢杆菌，大小(0.5～1.0) μm×(1.2～4.5) μm，偏端生芽孢，芽孢与菌体等宽，细胞多数呈链状(图1)。

图1 分离株Y3革兰氏染色显微照片Fig.1 The morphology of Y3 under microscopy

2.316SrDNA序列分析结果

从成品、原料和SIP水中分离了7株菌并进行了16S rDNA序列分析，序列结果提交GenBank获得登录号，详细信息见表2。

7株菌的鉴定结果为同一种细菌，最接近的为脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillusspp.)和人参土芽孢杆菌(Bacillusginsengihumi)，这两个种属的同源性达到99%～100%，用MEGA6.06构建进化树也显示7个分离株是同一种细菌(图2)，与脂环酸芽孢杆菌属和人参土芽孢杆菌都非常接近，无法有效区分，所以只能用生理生化测试来区分两者[15]，并且可与其他芽孢杆菌属有效区分。

表2 分离株基本信息

显示分离株最接近脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus spp.)或者是人参土芽孢杆菌(Bacillus ginsengihumi)。自展值为500，表示经过500次数值分析；图下标尺表示每200个碱基序列中有一个碱基替换。图2 MEGA 6.06用邻近法基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequences

2.4VITEK2Compact生理生化特性和鉴定结果

分离株采用全自动微生物鉴定仪VITEK 2Compact的革兰氏阳性菌鉴定卡(GN test kit) 做生理生化测试，VITEK 2Compact卡片要求37 ℃恒温好氧培养后鉴定，鉴定结果为未知菌(Unidentified organism)，其生理生化特性见表3。

表3 VITEK 2 Compact的革兰氏阳性鉴定卡测试结果

续表3

英文缩写生化试验结果英文缩写生化试验结果INO肌醇分解+MdG甲基葡萄糖甙酸化-GlyA氨基乙酸芳胺酶-dMAND-甘露醇+IRHAL-鼠李糖+BGLUβ-葡萄糖苷酶-dTAGD-塔格糖-dTRED-海藻糖-NaCl6.5%6.5%NaCl生长-KAN卡那霉素耐受-

2.5温度生长范围

15～60 ℃生长测试发现温度为55、60 ℃培养基中无肉眼可见混浊，15、45 ℃培养基中仅有少量混浊，28 ℃开始混浊明显，37～40 ℃培养基中浑浊度最高；因此初步确定该菌生长温度范围在15～45 ℃。37～40 ℃为最适生长温度。从生长温度范围来看该菌是普通中温菌，不同于脂环酸芽孢杆菌嗜高温特性，脂环酸芽孢杆菌生长温度范围为20～70 ℃,最适温度为40～60 ℃[16]。

2.6pH值生长范围

选取pH 2.0～9.0之间测试时发现pH 5.0和pH 6.0时该菌有明显混浊，pH 4.0和pH 7.0与空白对照比较浊度似有增加，并且在OSA平板上划线有少量菌落生长，而其余pH值则没有肉眼可辨的混浊，初步判断该菌生长范围在pH 4.0～7.30之间。进一步细化pH值梯度,使用全自动生长曲线分析仪测试，结果如图3。

图3 Y3在不同pH之间的生长曲线Fig.3 The growth curve of Y3 at different pH

从图3可见当pH 4.02时该菌株连续培养48 h OD值没有显著增长，当pH 7.30时48 h培养OD值略有上升，而pH值为pH 4.68/5.50/6.65时，OD值有显著上升，其中以pH 4.68时OD值增长最快，峰值最高，可以确认为该菌最适生长pH值。该菌与脂环酸芽孢杆菌嗜酸性特性(最适pH 3.5～4.5,pH 2.0～6.0之间都能生长)有着显著不同[16]。

2.7耐盐度测试结果

8.0%、10.0%和12.0% NaCl培养液中均有少量菌生长，而14.0%、16.0%、18.0%、20.0% NaCl培养液中没有肉眼可辨混浊。通过该实验确认人参土芽孢杆菌耐盐度可达12%。

2.8鉴定结果

根据16S rDNA序列分析该分离株应该是脂环酸芽孢杆菌属或者是人参土芽孢杆菌。但是鉴于标准株酸土脂环酸芽孢杆菌ATCC49025在PCA/OSA/MEA/LB/MRS培养基上都不生长，而分离株都生长良好；反之ATCC49025在YSG和BAT上生长良好，而分离株却不能生长，加上文献报道脂环酸芽孢杆菌一般培养温度为45 ℃，最适pH为3.0～3.8，而分离株几乎不能在这样的温度和pH值中生长，所以可以排除该分离株是脂环酸芽孢杆菌的可能性。鉴于该分离株与文献描述的人参土芽孢杆菌生理生化特性相似，结合分子生物学鉴定结果和生理生化结果可以判定该分离株为人参土芽孢杆菌。

3 结果与讨论

16S rDNA序列分析目前已成为细菌鉴定到属的重要方法之一，但是我们却发现脂环酸芽孢杆菌属和人参土芽孢杆菌的16S rDNA序列一致性达到99%～100%，非常接近并且无法有效区分，这种情况之前也有报道[15]，生理生化特性[15]、脂肪酶和脂酶的指纹分析都能很好地将这两者区分开[17]。有研究者用脂肪酸微生物鉴定系统(MIS) 分析芽胞杆菌属的90 个种和亚种(其中没有脂环酸芽孢杆菌)的脂肪酸成分将其分为5 个脂肪酸群，分别为第 I 群窄温芽胞杆菌脂肪酸群、第 II 群广温芽胞杆菌脂肪酸群、第 III 群嗜碱芽胞杆菌脂肪酸群、第 IV 群嗜酸芽胞杆菌脂肪酸群、第 V 群嗜温芽胞杆菌脂肪酸群，人参土芽孢杆菌属于group V中温菌群[18]。这和我们分离株的生长温度范围一致。鉴于分离株为中温菌生长pH范围为中性偏酸性(4.68～7.30)特性，该菌被鉴定为人参土芽孢杆菌。

从韩国人参种植园土壤中分离的人参土芽孢杆菌(B.ginsengihumi)在2007年首次被定义为新种，相关研究很少，从GenBank数据库登记的该菌16S rDNA序列信息来看，该菌曾在法国葡萄藤木质化组织[19]、我国陕西猕猴桃果园土壤和浙江铁皮石斛[20]、吊兰[21]、太空飞船组件的尘埃颗粒中[22]、灌溉用水[23]、澳大利亚土壤[24]和南非木屑[25]等处分离得到。可以推断该菌和其他芽孢杆菌一样主要分布在土壤中进而分布于植物、空气、水体中，所以我们在茶饮料原料茶叶和糖中也检出该菌并推测这些植物原料是最初的污染源。芽孢杆菌污染饮料通常是因为杀菌力不足，但是同厂同时期采用相同原料和杀菌参数的另一条茶饮料冷灌装线的产品正常说明人参土芽孢杆菌并不能耐受目前的杀菌参数。反复研究两条生产线的不同发现出现异常的生产线萃茶和灌装线共用同一CIP系统，部分CIP液回收反复利用，怀疑人参土芽孢杆菌能耐受CIP的酸洗、碱洗和热水洗从原料到萃茶线再通过CIP系统污染到灌装线。彻底清洗杀菌后将萃茶和灌装线CIP系统分开，异常情况就未再次出现。

因为绿茶饮料和OSA培养基的pH值均为6.0，MRS培养基的pH值为6.2，而PCA培养基的pH值为7.0，该菌生长pH范围较小，在7.0生长微弱，所以在OSA和MRS培养基中生长良好，而在最常用的细菌总数分离平板PCA上生长较差，细菌总数仅有前两者的1/10。

梅里埃的VITEK 2Compact全自动细菌鉴定系统是最成功商业化细菌鉴定系统，但是该系统的数据库有限，对新种、新属、变种或较为罕见的细菌分类结果往往会有偏差。对人参土芽孢杆菌这个相对研究较少的新种VITEK 2Compact则无法鉴定，但可以分析该菌株的生理生化特性。本次分离株虽然不是在含盐的环境中分离到的，但是却具有很高的耐盐性最高耐盐度达12%。

人参土芽孢杆菌是第一次作为食品污染菌被报道，该菌具有耐受CIP清洗的能力，一旦污染会导致长期持续性生产线污染值得业界关注。

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IdentificationandanalysisofBacillusginsengihumiinagreen-teabeveragedeterioration

WU A-bao1,HUANG Ting-xuan1,YANG Zu-shun2,GAO Wen1,ZHOU Guo-ping1*

1(School of Biological and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Hubei 430023,China) 2(Yunnan Center of Disease Control and Prevention,Kunming 650022,China)

The reason of one batch of green-tea beverage faded with precipitation was studied. Firstly, the contaminated microorganisms of the samples were counted and isolated on PCA, OSA and MRS agars. The isolates were identified to be close to bothAlicyclobacillusspp. andBacillusginsengihumiby 16S rRNA sequence analysis. It could grow from 15 to 45 ℃, while 37-40 ℃ was the best. And it could grow from pH 4.68 to 7.30, while pH 4.68 was the best. Those characters were greatly different from that ofAlicyclobacillus-the thermo-acidophilic bacteria but very similar to that of mesophilic bacteriaB.ginsengihumi. The bacteria were identified asB.ginsengihumi. The materials sugars and tea were suspected to be the pollution resources.B.ginsengihumimight contaminate filling system from extraction system through shared CIP systems while it was resistant to the cleaning of hot acid, water and lye.Bacillusginsengihumiwas firstly found to deteriorate a low acid drink-green tea beverage, with high resistance to CIP.

green-tea beverage;deterioration;Bacillusginsengihumi;Alicyclobacillus

本科(周帼萍教授为通讯作者,E-mail：wjczgp@163.com)。

武汉轻工大学大学生科研项目

2017-04-26,改回日期：2017-05-25

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014634