不同程度精索静脉曲张不育患者精索静脉高位结扎术后精子DNA碎片分析

曲仕浩，徐楗荧，罗英，陈取欣

（1.广东省珠海市妇幼保健院 泌尿外科，广东 珠海 519000；2.广东省阳江市妇幼保健院 普外科，广东 阳江 529500）

不同程度精索静脉曲张不育患者精索静脉高位结扎术后精子DNA碎片分析

曲仕浩1，徐楗荧1，罗英1，陈取欣2

（1.广东省珠海市妇幼保健院 泌尿外科，广东 珠海 519000；2.广东省阳江市妇幼保健院 普外科，广东 阳江 529500）

目的分析不同程度精索静脉曲张（VC）不育患者行精索静脉高位结扎术后精子DNA碎片的情况。方法不同程度VC不育患者57例。其中，诊断为2级患者27例，3级患者30例。所有患者行精索静脉高位结扎术前1个月及术后3个月检测并计算精子DNA碎片指数（DFI）。结果57例VC不育患者均行腹腔镜双侧精索静脉高位结扎术。VC 2级和3级患者行手术治疗后精子DFI与术前比较均值降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗前VC 2级和3级不育患者精子DFI比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后2级患者精子DFI低于3级患者（P＜0.05），DFI改善情况优于3级患者（P＜0.05）。结论腹腔镜精索静脉高位结扎术能够改善VC不育患者精子DNA碎片情况，对于2级患者效果更佳。

精索静脉曲张；精索静脉高位结扎术；精子DNA碎片；不育

精索静脉曲张（varicocle，VC）是指精索内蔓状静脉丛的异常伸长、扩张和迂曲。多见于青壮年，发病率约占男性人群的10.0%～15.0%；在不育男性中发病率为25.0%～40.0%，是引起男性不育症的主要病因之一[1-2]。研究显示[3-5]，VC引起睾丸局部温度增高，氧自由基（reactive oxygen species，ROS）过多和抗氧化酶的平衡失调，造成精子DNA单链和双链的断裂，导致精子DNA碎片增多而影响男性生育。精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）是一个稳定性高的指标，VC患者的精子活动力密度和形态分析可在正常范围，但是精子DFI明显高于正常。20世纪90年代开始腹腔镜下进行精索内静脉高位结扎手术，手术创伤小、疗效好、恢复快，目前已广泛应用于临床[6-7]。本研究分析不同程度VC不育患者行精索静脉高位结扎术后精子DNA碎片的情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年2月-2016年8月在珠海市妇幼保健院和阳江市妇幼保健院就诊的VC不育患者共57例。诊断标准[8]：按照《2014版中国泌尿外科临床诊断治疗指南》将精索静脉曲张分为4级。0级：未表现出VC症状，Valsalva试验未出现，经彩色多普勒检查发现轻微的VC，静脉管径超过1.8 mm；1级：触诊不明显，但Valsalva试验时可出现；2级：在触诊时极易触及扩张静脉，但肉眼不能看见；3级：患者站立时肉眼能看到扩张静脉在阴囊皮肤突现，如团状蚯蚓，容易触摸到。纳入标准：①术前检查DFI＞20.0%；②至少一侧为2级及以上VC；③不育年限≥2年；④无其他不育原因。依据诊断标准及纳入标准，进入本研究的VC 2级患者27例，年龄（32.6±4.9）岁，不育年限（3.3±1.5）年；VC 3级患者30例，年龄（33.7±6.5）岁，不育年限（3.8±1.8）年。两组患者年龄及不育年限比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有患者均无家族遗传病史，无其他内、外科疾病及手术禁忌。

1.2 手术方法

所有患者均行腹腔镜双侧精索静脉高位结扎术。术前常规留置导尿管，取平卧位，行气管插管全身麻醉。麻醉满意后，术区常规消毒、铺巾。于脐下缘作一长约1.5 cm切口，置入气腹针，注入二氧化碳CO2气体建立气腹，设定腹腔压力13～15 mmHg。取15°头低脚高位，于脐下缘切口置入Trocar后进入腹腔镜，接监视器，观察双侧腹膜后精索静脉，于左、右侧髂前上棘与脐连线中点分别作一长约0.5 cm切口并置入Trocar，距内环口约3.0 cm处将肠管推向近心端，充分暴露术野，用双极电凝钩切开曲张静脉表面后腹膜，分离出精索动脉后，充分游离曲张的精索静脉并用4号丝线于近心端及远心端分别将其结扎，观察术野无出血后，退出腹腔镜，将CO2气体充分释放，术后4 h拔除尿管自行排尿。

1.3 实验方法

应用精子染色质扩散法（sperm nucleus DNA kit，SCD）检测精子核DNA完整性，试剂盒购自深圳华康生物医学工程有限公司。步骤简述如下：①试剂盒取出放置室温平衡30～60 min，将低熔点琼脂糖管的凝胶完全熔解备用；②用精子稀释液将精液密度调至5～10×106/ml，取60μl稀释的精液标本加入到低熔点琼脂糖管中混匀；③将含有精子的低熔点琼脂糖悬浮液取出30μl滴加到载玻片，盖上盖玻片；④将预处理后的载玻片置入4℃冰箱冷却4 min，移走盖玻片，迅速将预处理的载玻片放入变性液中7 min，蒸馏水中浸泡5 s，再浸入裂解液中反应20 min；⑤反应完毕，将预处理的载玻片浸入洗涤液3 min，再依次浸入70%乙醇、90%乙醇、无水乙醇溶液中脱水各2 min；⑥将预处理的载玻片自然晾干后用瑞氏染色剂进行染色，显微镜下观察。

精子DNA碎片结果判定标准：根据晕环与精子头部直径比例，分为大晕环精子（单侧晕环宽度≥2/3精子头部最小直径）、中晕环精子（1/4精子头部最小直径＜单侧晕环宽度≤2/3 精子头部最小直径）、小晕环精子（单侧晕环宽度≤1/4精子头部最小直径）、无晕环精子以及退化精子。精子DFI计算公式[9]：DFI=（小晕环精子＋无晕环精子＋退化精子）/计数精子总数×100.0%。

1.4 疗效评判标准

所有患者均于行精索静脉高位结扎术前1个月及术后3个月检测DFI，以精子DFI改善率评价疗效。DFI改善率[10]=[（治疗前DFI-治疗后DFI）/（治疗前DFI-23.0%）]×100.0%。治疗后改善率＜30.0%为无效，30.0%≤改善率＜60.0%为有效，60.0%≤改善率＜90.0%为显效，DFI≤23.0%或改善率≥90.0%为治愈。

1.5 统计学方法

数据应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间正态分布资料比较用两样本t检验，同级手术前后比较用配对t检验；计数资料以率（%）表示，两组间比较用χ2检验。检验标准取双侧α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

57例VC不育患者均行腹腔镜双侧精索静脉高位结扎术，镜下观察精子核DNA完整性（附图），评判精子DNA碎片结果并计算DFI。2级和3级患者行手术治疗后精子DFI与术前比较均值降低，经配对t检验分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗前VC 2级和3级不育患者精子DFI比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后2级患者精子DFI低于3级患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。治疗后2级患者精子DFI改善情况优于3级患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

附图 精子核DNA完整性Attached fig. Sperm nucleus DNA integrity

表1 不同程度VC不育患者手术治疗前后精子DFI比较 （%，±s）Table 1 Comparison of sperm DFI before and after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility （%，±s）

表1 不同程度VC不育患者手术治疗前后精子DFI比较 （%，±s）Table 1 Comparison of sperm DFI before and after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility （%，±s）

组别 治疗前精子DFI 治疗后精子DFI t值 P值2级（n =27） 37.0±7.6 26.9±5.9 12.75 0.000 3级（n =30） 37.5±6.9 30.7±6.4 14.95 0.000 t值 0.28 2.29 P值 0.782 0.026

表2 不同程度VC不育患者手术治疗后精子DFI改善情况分析 例（%）Table 2 Improvement of sperm DFI after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility n（%）

3 讨论

目前常规精液分析不能全面评估男性的生育能力，而精子DNA碎片化程度被认为是一个新的预测生育能力的指标，间接反映精子遗传物质的完整性，与生育能力呈负相关，且不随季节发生变化[11-12]。目前所应用的判定方法是观察特征性的光晕，没有DNA碎片的精子在经过酸变性和去掉核蛋白后DNA扩散形成光晕，而带有DNA碎片化的精子不会产生这种光晕，根据光晕的有无和大小判断精子DNA碎片化的程度。

精子DNA碎片化发生机制：①精子发生过程中异常染色质包装：染色质是由一条DNA分子缠绕无数核小体核心而连成一条串珠样长链形成的核蛋白纤维。精子发生过程中染色质核蛋白经历了从组蛋白-过渡蛋白-鱼精蛋白的转变，鱼精蛋白对于维持精子正常形态和DNA完整性起到至关重要的作用，其含量与精子DFI呈负相关[13]。鱼精蛋白自身缺陷或功能异常，精子染色质浓缩过程异常，导致精子DFI指数升高。而且，内源性核酸酶在精子发生过程中也参与了染色质的组装[14]；②ROS增多：精子DNA对ROS极为敏感，生理浓度的ROS有利于精子的受精，ROS过多和抗氧化酶的平衡失调，会造成精子DNA单链和双链的断裂，导致精子DNA损伤[15]。受损伤的精子DNA更容易受到ROS的攻击，形成恶性循环，最终使精子DNA损伤逐渐加重，畸形精子增加影响男性生育。研究显示[16]，不育症患者精液中ROS水平及精子DNA损伤的程度明显高于正常人。而且，精液中异常增多的白细胞也可以诱导精子产生过量的ROS，损伤精子DNA结构的完整性；③凋亡异常：凋亡是细胞死亡方式中的一种，是指细胞的程序化死亡。在一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序，自动结束其生命的过程，Fas、Bcl-x和p53是调控细胞凋亡的主要基因[17]。当控制凋亡的基因异常表达，细胞凋亡发生异常，不能及时去除DNA受损的精子，导致精子DNA碎片化。而且，精子DNA损伤影响精子密度，这部分精子比例增高时精子密度降低，精子的质量也受到影响，引起受精功能障碍及胚胎发育异常等，导致男性不育[18]。

目前，已公认VC可影响男性生育，但其病理和生理机制尚未十分明确。VC引起精索静脉内血液滞留，睾丸局部缺氧、代谢性酸中毒、无氧酵解增强，腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）被分解为次黄嘌呤，并在黄嘌呤氧化酶的作用下产生ROS。VC患者睾丸组织中存在高水平的脂质过氧化，ROS的过度产生导致精子DNA碎片增多，引起不育[19]。而且，VC也会导致生精细胞凋亡异常及精子凋亡相关表型增加，包括精子质膜磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻、线粒体功能障碍及精子DNA损伤[20]。研究显示[21]，VC患者行精索静脉高位结扎术能改善精液质量和睾丸容积，精液参数明显改善，精子DNA碎片明显减少，精子DFI降低后能够有效提高女方受孕率。本研究显示，2级和3级精索静脉曲张不育患者术前存在不同程度的精子DNA碎片，行腹腔镜精索静脉高位结扎术后精子DFI降低，精子DNA碎片情况得到改善。与3级VC不育患者比较，2级患者治疗效果更为显著。

本研究存在的不足之处：①常规精液分析是用于判断男性生育力最基本的临床指标，但是部分患者手术前的精液分析是正常的，本研究未对患者行手术治疗前后精液常规的比较；②VC 1级患者无临床不适症状，即使已影响生育，能够接受腹腔镜手术的患者较少，所以本研究未纳入此部分患者；③由于进行研究的时间短，样本量较少，后续需扩大样本量；④评价VC不育患者手术治疗效果具有社会价值的方法是女方妊娠情况，对于妊娠率、胎儿畸形率及新生儿活产率等观察指标，已纳入后续的研究中。

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Analysis of the sperm DNA fragmentation in different degrees of varicocele infertility patients after high ligation of the spermatic vein

Shi-hao Qu1, Jian-ying Xu1, Ying Luo1, Qu-xin Chen2
(1.Department of Urology, Zhuhai Maternal and Children’s Hospital, Zhuhai, Guangdong 519000,China; 2.Department of General Surgery, Yangjiang Maternal and Children’s Hospital,Yangjiang, Guangdong 529500, China)

ObjectiveTo analyze the sperm DNA fragmentation in different degrees of varicocele (VC)infertility patients after high ligation of the spermatic vein.MethodsThere were 57 patients with different degrees of VC infertility patients. 27 patients had been diagnosed with level two VC, and 30 patients had been diagnosed with level three VC. All patients’ sperm DNA fragmentation index (DFI) were detected and calculated at preoperative one month and postoperative three months.Results57 VC infertility patients were all suffered from laparoscopic high ligation of the spermatic vein on both sides. There was no statistically difference on preoperative sperm DFI between level two and level three patients (P＞ 0.05). All patients’ sperm DFI were decreased after laparoscopic (P＜ 0.05), and level two VC infertility patients had signi fi cant greater progress than level three patients(P＜ 0.05).ConclusionLaparoscopic high ligation of the spermatic vein can effectively improve VC infertility patients sperm DFI. It would be better for level two VC infertility patients.

varicocle; high ligation of the spermatic vein; sperm DNA fragmentation; infertility

R697.24

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2017.08.013

1007-1989（2017）08-0061-05

2016-12-19

徐楗荧，E-mail：qsh0601@sohu.com

（吴静 编辑）