不同产地贯叶金丝桃高效液相色谱指纹图谱研究

唐小龙，罗旭，陈波，王小林，杨宋琪，陈海燕，柯潇

（四川济生堂药业有限公司，四川成都610041）

不同产地贯叶金丝桃高效液相色谱指纹图谱研究

唐小龙，罗旭，陈波，王小林，杨宋琪，陈海燕，柯潇

（四川济生堂药业有限公司，四川成都610041）

目的建立贯叶金丝桃的高效液相色谱指纹图谱分析方法。方法以高效液相色谱法对12批次不同产地贯叶金丝桃药材的指纹图谱进行分析，采用金丝桃苷对照品进行峰指认，从相似度、相对保留时间、相对峰面积方面进行指纹图谱分析。结果12批次贯叶金丝桃药材的相似度均大于0.900。结论该方法简便、可行，能有效指导贯叶金丝桃药材的质量评价。

贯叶金丝桃；指纹图谱；高效液相色谱法

贯叶金丝桃来源于藤黄科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分，性平，味辛、苦涩，具有疏肝解郁、清热利湿、消肿通乳的功效。贯叶金丝桃主要分布于甘肃、新疆等地，主要含有萘并二蒽酮类、间苯三酚类、黄酮类、双黄酮类、苯丙烯酸类和花青素等成分，还含有少量的单宁酸、氧杂蒽酮、挥发油和氨基酸等[1－4]。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法，建立了一种新的指纹图谱分析法，并对不同产地贯叶金丝桃药材进行分析，为其质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（包括四元泵、紫外检测器、柱温箱、自动进样器、工作站，安捷伦科技＜中国＞公司）；BP－211D型电子天平(德国赛多利斯公司)；Milli－Q型纯水器(美国Milli公司)。

1.2 试药

试验药材购于甘肃、陕西、四川等地（见表1），由成都康弘药业集团国家企业技术中心叶亮教授鉴定为藤黄科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分；金丝桃苷对照品（批号为111521－201406，含量为92.5%）购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1 贯叶金丝桃药材的产地

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A为乙腈，B为0.1%磷酸，梯度洗脱（见表2）；柱温：35℃；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

称取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芦丁金丝桃苷60 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品粉末(过3号筛)约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入60%乙醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，用60%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

表2 梯度洗脱程序

2.3 方法学考察

精密度试验：称取贯叶金丝桃药材，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液1份，按拟订色谱条件，连续进样6次，记录60 min色谱图。以金丝桃苷峰（8号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果的RSD均小于3.0%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验：称取贯叶金丝桃药材，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液5份，按拟订色谱条件测定，记录60 min色谱图。结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%(n＝5)，表明方法重复性良好。

稳定性试验：精密吸取同1份供试品溶液1份，按拟订色谱条件分别于1，8，16，24，48 h时测定，记录60 min色谱图。结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.4 指纹图谱分析

取S1～S12 12批不同产地的贯叶金丝桃药材，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，以8号峰贯叶金丝桃特征成分金丝桃苷作为参照峰，得出12批次贯叶金丝桃药材指纹图谱的15个共有峰（见图1）和标准指纹图谱（见图2），各共有峰相对保留时间见表3。

图1 12批贯叶金丝桃药材指纹图谱

图2 贯叶金丝桃标准指纹图谱

表3 贯叶金丝桃指纹图谱共有峰相对保留时间

2.5 指纹图谱相似度评价

将S1～S12 12个不同产地样品的色谱数据导入中药指纹图谱相似度评价系统（2004A），考察色谱峰相似度的一致性，进行相似度评价。不同产地的贯叶金丝桃药材指纹图谱的主要峰群的整体图貌基本一致，共有峰的相对保留时间一致，相似度评价结果显示，样品S1～S12相似度分别为0.971，0.978，0.944，0.946，0.985，0.963，0.971，0.956，0.988，0.973，0.986，0.969，均在0.900以上。

3 讨论

[5－10]方法，本试验中经多次筛选、优化，建立了贯叶金丝桃HPLC指纹图谱方法。分别考察了以乙腈－0.1%磷酸、甲醇－0.1%磷酸为流动相时供试品溶液的分离效果，用乙腈作为有机相，主要色谱峰的分离效果较好；考察了水、0.1%磷酸、1%磷酸、磷酸氢二钠等流动相，除水出现色谱峰较宽和有拖尾现象外，其他峰形均较好。最后选用经济、简便的0.1%磷酸作为水相，因此，综合考虑乙腈－0.1%磷酸作为流动相。

分别考察了260，280，360 nm波长下产生的色谱图，结果显示360 nm波长处峰数较少，而且峰高较低，260 nm和280 nm波长处峰数较多，但280 nm波长处峰高较高，且基线平稳，峰数也相对理想，分离效果也较好，因此选择280 nm作为检测波长。

分别考察了30，35，40℃的柱温，结果显示35℃保留时间和分离效果较好。

本试验中考察的12批次贯叶金丝桃药材主要来源于甘肃、陕西、四川、湖北等地，结果显示，不同产地贯叶金丝桃药材色谱图中15个共有峰的相对保留时间基本一致，但不同批次共有峰峰面积有一定差异，可能与药材产地的土壤、气候、时间、种植方式等有关。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2015：231－232.

[2] 周娟，胡英杰，肖敏勋，等.贯叶金丝桃的黄酮类成分研究[J].广州中医药大学学报，2006，23（5）：416－418.

[3] 曹纬国，刘志勤，邵云，等.黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报，2003，23(12)：2241－2247.

[4] 王卫星，胡新颖，刘鹏，等.金丝桃苷等10个天然黄酮类化合物的抗抑郁活性筛选研究[J].中草药，2007，38（6）：900－902.

[5] 李晓坤，刘炯，张杰，等.HPLC指纹图谱技术对3种贯叶连翘提取物制备工艺的评价[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（15）：10－13.

[6] 韩霖，刘妍如，杨建云，等.贯叶连翘提取物中金丝桃苷含量的RP－HPLC法测定[J].时珍国医国药，2012，23（10）：2432－2434.

[7] 张俊松，王晓利，罗谦，等.贯叶连翘的HPLC指纹图谱[J].华西药学杂志，2006，21（5）：440－442.

[8] 方玲，陈方亮，于翠琴，等.不同产地乌药的HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2013，44(2)：229－231.

[9] 于桂芳，闫显光，殷洪梅，等.益心舒片的HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2017，23(1)：69－74.

[10] 金玲，娄涛涛，刘璇，等.辣木叶的HPLC指纹图谱[J].中国实验方剂学杂志，2017，23(8)：86－91.

HPLC Fingerprint of Hypericum Perforatum form different Habitats

Tang Xiaolong,Luo Xu,Chen Bo,Wang Xiaolin,Yang Songqi,Chen Haiyan,Ke Xiao
(Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.Ltd.,Chengdu,Sichuan,China610041)

ObjectiveTo establish an HPLC fingerprint analysis method for Hypericum perforatum.MethodsTwelve batches of Hypericum perforatum from different habitats were analyzed by HPLC fingerprints method,the peaks were identified by reference substance of Hypericum perforatum,the fingerprints were analyzed from the aspects of similarity,relative retention time and relative peak area.Results The similarity of twelve batches of Hypericum perforatum was more than 0.900.ConclusionThe method is simple and feasible,which can guide the quality evaluation of Hypericum perforatum.

Hypericum perforatum;fingerprint;HPLC

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)21－0012－03

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.21.005

四川省重大产业技术创新专项[2012CD00082]；四川科技成果转化项目[2012SC0029]。

唐小龙（1987－），男，硕士研究生，工程师，研究方向为中药质量标准，（电子信箱）594195569＠qq.com。

柯潇（1983－），男，硕士研究生，高级工程师，研究方向为中药新药，（电话）028－64287669。

2017－05－23)