雷帕霉素预处理对大鼠肢体缺血－再灌注肺损伤的影响

袁志军，唐斌，罗振中，黄丹

（1.江西省分宜县中医院，江西新余336600；2.南昌大学第二附属医院，江西南昌336600）

雷帕霉素预处理对大鼠肢体缺血－再灌注肺损伤的影响

袁志军1，唐斌2，罗振中2，黄丹2

（1.江西省分宜县中医院，江西新余336600；2.南昌大学第二附属医院，江西南昌336600）

目的探讨雷帕霉素预处理对大鼠肢体缺血－再灌注肺损伤的影响，为临床应用及预防提供理论参考。方法将60只健康雄性SD大鼠采用随机数字表法均分为对照组（C组）、肢体缺血－再灌注组（I/R组）、雷帕霉素预处理组(R组)3组，各20只。所有动物缺血前12 h禁食，自由饮水，麻醉后固定于操作台，于右侧腹股沟处切开皮肤，暴露股动脉、股静脉和股神经；C组仅分离股动脉、股静脉和股神经；I/R组和R组用无创血管夹于接近腹股沟韧带处夹闭股动脉，迫使大鼠双后肢缺血2 h，后取去血管夹使得再灌注3 h；R组于下肢缺血前灌胃雷帕霉素。应用超声血流仪监测血流，以未监测到血液流动为缺血，监测到血液流动为再灌注的指标；再灌注3 h后处死大鼠，心脏取血2 mL，离心取血清，硫代巴比妥法测定丙二醛（MDA）的浓度，酶联免疫吸附(ELISA)法检测白细胞介素（IL）－1 、IL－6和肿瘤坏死因子－ （TNF－ ）的浓度；取肺组织计算干湿比及行免疫组化观察肺组织病理学结果。结果与C组比较，I/R组肺W/D、血清MDA，IL－1 ，IL－6和TNF－ 水平均明显升高(P＜0.01)，与I/R组比较，R组肺W/D，血清MDA，IL－1 ，IL－6和TNF－水平均明显降低(P＜0.05)；光镜下C组大鼠的肺组织纹理结构尚完整，肺泡间隔均匀一致，见少量炎性细胞浸润，肺泡腔清楚可见；I/R组大鼠肺泡上皮细胞增生，肺间质明显增生，肺泡壁增厚，可见大量的炎性细胞浸润，毛细血管明显扩张充血，肺泡壁及肺泡间质中可见大量中性粒细胞；R组大鼠肺组织病理改变较I/R组明显减轻，炎性细胞浸润明显减少，仅有少量红细胞渗出。结论雷帕霉素预处理可减轻肢体缺血－再灌注诱发肺损伤，其机制可能与抗氧化应激和抗炎反应有关。

雷帕霉素；肢体缺血－再灌注；肺损伤

肢体缺血－再灌注损伤是临床常见的病理过程，压迫止血带的临床应用、冠状动脉粥样硬化致血栓的形成等因素均可引起下肢缺血－再灌注[1－3]。雷帕霉素(rapamycin，RPM)是放线菌培养液中分离的大环内酯类抗生素，最早作为一种抗真菌药物被研究。20世纪初，由美国食品药物管理局（FDA）批准，其又成为应用于器官移植抗排斥反应的一种安全性较高的新型免疫抑制剂[3]。RPM可结合哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR），通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，特异性抑制mTOR，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，抑制细胞增殖，降低诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的稳定性，进而减少细胞内一氧化氮的生成[4]，从而发挥免疫抑制效应[5]。RPM还可以通过抑制mTOR诱导自噬，从而有助于正常的细胞代谢[6]。有研究表明，在体内和体外的相关疾病模型中，RPM均能明显抑制小胶质细胞的活化和肿瘤坏死因子－α(TNF－α)水平的下调，从而阻止细胞的程序性死亡[7－8]。近期研究表明，RPM在肾脏缺血－再灌注及肝脏缺血－再灌注损伤中具有保护作用，但是否对肢体缺血－再灌注肺损伤具有保护作用尚不清楚。本研究中通过利用大鼠肢体缺血－再灌注肺损伤模型，探讨RPM预处理对肢体缺血－再灌注大鼠肺损伤的影响，以期为临床RPM的药物应用预防治疗缺血－再灌注肺损伤提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组

60只健康雄性SD大鼠(编号为S20785)，体质量200～250 g，由南昌大学实验动物科学部提供。采用随机数字表法分为对照组（C组）、肢体缺血－再灌注组（I/R组）、雷帕霉素预处理组(R组)，各20只。

1.2 建模型

所有大鼠缺血前12 h禁食，自由饮水，腹腔内注射10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司，国药准字H37022673，规格为3 mL/kg)麻醉，麻醉生效后固定于操作台。在右侧腹股沟处切开皮肤，暴露股动脉、股静脉和股神经。C组仅分离股动脉、股静脉和股神经，不做任何操作。于大鼠双后肢股三角区切开皮肤，分离股动脉、股静脉；I/R组和R组用无创血管夹于近腹股沟韧带处夹闭股动脉，使双后肢缺血2 h再灌注3 h。采用超声血流仪监测血流以保证肢体缺血－再灌注成功实施，以未监测到血流为缺血，监测到血流为再灌注的标准。R组于下肢缺血前灌胃给药雷帕霉素[武汉德美凯生物科技有限公司，CAS号为53123－88－9，规格为10 mg/(kg·d)]，最后1次于术前2 h灌胃。I/R组和C组于下肢缺血前给等量生理盐水灌胃，作为阴性对照。

1.3 观察指标与方法

再灌注3 h时，心脏放血处死大鼠，开胸，用注射器经心尖部刺入心脏，缓慢抽血液2 mL，离心，取血清，采用硫代巴比妥法测定丙二醛（MDA）的浓度，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测白细胞介素（IL）－1β、IL－6和肿瘤坏死因子－α（TNF－α）的浓度。采集血样后，取右肺上叶组织，常规进行石蜡包埋、切片和HE染色，光镜下(×100)观察肺组织病理学结果。取右肺下叶组织，冲洗干净后，吸干表面水分，用干燥锡纸包裹标本，取肺组织约100 mg，于分析天平上测定湿重(W)，后于120℃下烘烤8 h后称取其干重(D)，计算并比较肺W/D比值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差(s)表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察指标

与C组比较，I/R 组肺W/D（t＝3.53，P＝0.01），血清MDA（t＝4.41，P＝0.00），IL－1β（t＝4.01，P＝0.01），IL－6（t＝5.93，P＝0.03）和TNF－α（t＝4.92，P＝0.00）水平均明显升高；R组肺W/D（t＝3.12，P＝0.03），血清MDA（t＝3.93，P＝0.01），IL－1β（t＝4.00，P＝0.00），IL－6（t＝4.61，P＝0.00）和TNF－α（t＝4.13，P＝0.01）水平均明显升高；与I/R组比较，R组肺W/D（t＝2.53，P＝0.04），血清MDA（t＝2.81，P＝0.01），IL－1β（t＝3.01，P＝0.00），IL－6（t＝4.73，P＝0.01）和TNF－α（t＝4.59，P＝0.00）水平均明显降低。详见表1。

2.2 光镜下肺组织结构

光镜下C组大鼠的肺组织结构完整，肺泡间隔均匀一致，可见少量炎性细胞浸润，肺泡腔清晰（图1 A）；I/R组大鼠肺泡上皮细胞增生，肺间质明显增生，肺泡壁增厚，可见大量的炎性细胞浸润，毛细血管明显扩张充血，肺泡壁及肺泡间质中可见大量中性粒细胞（图1 B）；R组大鼠肺组织病理改变较I/R组明显减轻，炎性细胞浸润明显减少，仅有少量红细胞渗出（图1 C）。

表1 3组大鼠各项指标比较(s，n＝20)

表1 3组大鼠各项指标比较(s，n＝20)

注：与C组比较， P＜0.01；与I/R组比较，＃P＜0.05。

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图1 光镜下3组大鼠肺组织结构(HE，×100)

3 讨论

肢体缺血－再灌注不仅可引起局部组织的不同程度改变，还可以引起其他远处器官系统的损伤，严重者甚至导致多器官功能障碍(MODS)[9]，肺脏因容易呈高灌注状态、与外界空间接触面积大和对LIR产生的炎性介质非常敏感等多种因素而导致其最易受累病变，严重时临床表现多为急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[10－11]，临床表现常为非心源性的肺水肿、肺动脉压升高、动脉血氧分压降低及肺的顺应性下降等改变。目前认为，氧化应激反应是LIR致肺损伤的重要机制[12]，多形核中性粒细胞(PMN)的激活、粘附、运输而生成的有毒物质是造成此种病症的关键因素，从再灌注组织中释放入血的物质是使中性粒细胞激活及在肺中聚集而产生效应的必要物质。氧自由基的大量生成、白细胞的渗透作用及炎性因子释放等多种因素同时作用于肺部血管内皮细胞，破坏其完整性，增加血管通透性，引起肺组织水肿和换气功能的障碍[13]。常见于肢体再植、大血管栓塞及损伤、高位离断、严重挤压伤及肢体手术时期长时间止血带压迫恢复血流灌注时引起的肺功能损害。因此，加强围术期肺组织的保护，减少肺的损伤，对术后疾病的预后转归有较深远的影响。

RPM为免疫抑制剂，也是一种经典的自噬诱导剂，通过抑制自噬反应途径中RPM靶蛋白从而促进细胞自噬的发生。但RPM对临床上最常见的LIR导致肺损伤是否具有保护作用目前报道尚少，本试验通过RPM对LIR肺损伤的保护效应，效果满意，为预防和减轻肢体缺血－再灌注肺损伤提供参考。

[1] Szijirtó A，Turóczi Z，Szabó J，et al.Rapidly progressing fatal reperfusion syndrome caused by acute critical ischemia of the lower limb[J].Cardiovasc Pathol，2013，22(6):493－500.

[2] Budic I，Pavlovic D，Kitic D，et al.Tourniquet－induced ischemiareperfusion injuries during extremity surgery at children′s age:impact of anesthetic chemical structure[J].Redox Rep，2013，18(1):20－26.

[3] Hoffman JJ，Gilberttb TB，Poston RS，et al.Myocardial reperfusioninjury:etiology，mechanisms，and therapies[J].Extra Corpora Techno，2007，36(4):391－411.

[4] Lisi L，Navarra P，Feinstein DL，et al.The mTOR kinase inhibitor rapamycin decreases iNOS mRNA stability in astrocytes[J].J Neuroinflammation，2011，8(1):1－11.

[5] Woolbright BL，Jaeschke H.Heme oxygenase－1 and platelets in hepatic ischemia reperfusion injury[J].J Gastroenterol Hepatol，2013，28(5):756－757.

[6] Liu NN，Zhao N，Cai N.Suppression of the proliferation of hypoxia－Induced retinal pigment epithelial cell by rapamycin through the/mTOR/HIF－1 /VEGF/signaling[J].IUBMB Life，2015，67(6):446－452.

[7] Malagelada C，Jin Z，Jackson－Lewis V，et al.Rapamycin protects against neuron death in vitro and in vivo models of Parkinson′s disease[J].Neurosic，2010，30(3):1166－1175.

[8] Cicora F，Lausada N，Vasquez DN，et al.Sirolimus in kidney transplant donors and clinical and histologic improvement in recipients:Rat model[J].Transplant Proc，2010，42(1):365－370.

[9] Liu Y，He Y，Wu X，et al.Heparin attenuates HMGB1 expression in arterial tissue subjected to limb ischemia/reperfusion[J].Int J Cardiol，2014，176(2):543－546.

[10] Yu L，Luo Q，Fang H.Mechanism of ulinastatin protection against lung injury caused by lower limb ischemia－reperfusion[J].Panminerva Med，2014，56(1):49－55.

[11] Garbaisz D，Turóczi Z，Fülöp A，et al.Postconditioning can reduce long－term lung injury after lower limb ischemia－reperfusion[J].Magy Seb，2013，66(3):146－154.

[12] Kao MC，Jan WC，Tsai PS，et al.Magnesium sulfate mitigates lung injury induced by bilateral lower limb is chemiareperfusion in rats[J].J Surg Res，2011，171(1):e97－e106.

[13] Weng TI，Wu TY，Chen BL，et al.C/EBP homologous protein

deficiency aggravates acute pancreatitis and associated lung injury[J].World J Gastroenterol，2013，19(14):7097－7105.

Effect of Rapamycin Pretreatment on Lung Injury Induced by Limb Ischemia－Reperfusion in Rats

Yuan Zhijun1,Tang Bin2,Luo Zhenzhong2,Huang Dan2
(1.Fenyi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinyu,Jiangxi,China 336600;2.The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi,China 336600)

Objective To investigate the effect of rapamycin pretreatment on lung injury induced by limb ischemia－reperfusion in rats,to provide theoretical basis for clinical application and its prevention and treatment of lung injury induced by limb ischemia－reperfusion.M ethodsTotally 60 healthy male SD rats were divided into control group(group C),limb ischemia reperfusion group(group I/R),rapamycin pretreatment group(group R)by random number table method,20 cases in each group.12 h before ischemia,all were fasted,free drinking water and fixed on the operating table after anesthesia.In the right groin skin incision,the exposed femoral artery,femoral vein and femoral nerve.Only femoral artery,femoral vein and femoral nerve separated in group C,the femoral artery was clamped at the proximal inguinal ligament with a noninvasive vascular clamp in group I/R and group R,in order to force the hind limb of the rats to undergo ischemia for 2 h,and the vascular clamp was removed to make the reperfusion for 3 h.In group R,rapamycin was injected into the lower limb before ischemia.TTFM was used to monitor blood flow,no blood flow was monitored for ischemia,and blood flow was monitored as an indicator of reperfusion.After reperfusion for 3 h,the rats were sacrificed,and 2 mL blood was taken from the heart,the blood serum was taken by centrifuging.The concentration of MDA was determined by thiobarbituric acid method,and the levels of IL－1β,IL－6 and TNF－α were detected by ELISA.The lung tissue was taken,and the pathological results of lung tissue were observed by calculating the ratio of dry－wet and immunohistochemistry.Results Compared with group C,theconcentration of W/D in lung,serum MDA,IL－1β,IL－6 and TNF－α in group I/R increased significantly(P＜0.01).Compared with I/R group,the concentration of W/D in lung,serum MDA,IL－1β,IL－6 and TNF－α in group R decreased significantly(P＜0.05).Under light microscope,the structure of lung tissue in group C was intact,and the alveolar septa were uniform.A few inflammatory cells were infiltrated,and the alveolar cavity was clearly visible.In group I/R,the proliferation of alveolar epithelial cells,the obvious interstitial proliferation of lung and the thickening of alveolar wall wereobserved,a large number of inflammatory cell infiltration and capillary expansion and congestion wereobserved,and a large number of neutrophils were found in the alveolar wall and alveolar stroma.The pathological changes of lung tissue in group R were significantly less than those in group I/R,the infiltration of inflammatory cells was significantly reduced,only a small amount of red blood cells were exuded.Conclusion Rapamycin pretreatment can reduce lung injury induced by limb ischemia－reperfusion,and its mechanism may be related to antioxidant stress and anti－inflammatory response.

rapamycin;limb ischemia－reperfusion;lung injury

R965.2；R978.1

A

1006－4931(2017)21－0007－03

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.21.003

江西省卫生计生委科技计划项目[20165283]。

袁志军（1979－），男，大学本科，研究方向为麻醉医学，（电子信箱）984391041＠qq.com。

黄丹(1981－)，硕士研究生，主治医师，主要从事器官缺血再灌注保护方面的研究，(电子信箱)tanghuang05＠163.com。

2017－06－29；

2017－07－28)