6-姜酚对抗丙酮醛引起的HK-2肾小管上皮细胞损伤的机制

陈燕玲*，罗 婷，凡 栋，吴秀香，王晓玲，黄霜枝

（遵义医学院珠海校区病理生理学教研室，广东 珠海 519041）

・基础研究・

6-姜酚对抗丙酮醛引起的HK-2肾小管上皮细胞损伤的机制

陈燕玲*，罗 婷，凡 栋，吴秀香，王晓玲，黄霜枝

（遵义医学院珠海校区病理生理学教研室，广东 珠海 519041）

目的探讨6-姜酚对丙酮醛引起的HK-2肾小管上皮细胞（HK-2细胞）损伤的可能机制。方法 实验分为四组：对照组、丙酮醛损伤组、丙酮醛+6-姜酚组（丙酮醛与6-姜酚共处理）及6-姜酚组。用DCFH-DA（双氯荧光素）染色法检测HK-2细胞内活性氧（ROS）的水平；比色法测点细胞SOD（超氧化物歧化酶）活力；western blot法检测NF-κB蛋白表达水平。结果 与对照组相比，丙酮醛损伤组HK-2细胞内ROS水平明显增高，SOD活力明显降低，而NF-κB蛋白表达水平明显增高；加入6-姜酚处理后，HK-2细胞内ROS水平及NF-κB蛋白表达水平明显降低，而SOD活力明显增高。结论 6-姜酚对抗丙酮醛引起的HK-2细胞损伤的机制可能与其提高细胞抗氧化能力及抑制NF-κB介导的炎症通路有关。

6-姜酚；丙酮醛；氧化应激；NF-κB

干姜是一种传统的药食两用植物，从干姜中分离出姜酚的结晶体，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等，其中6-姜酚是干姜中最主要的活性成分[1]。本课题组之前的研究发现，6-姜酚可以对丙酮醛引起的HK-2肾小管上皮细胞损伤具有明显的保护作用，但其机制未明。因此，本研究旨在探讨6-姜酚对抗丙酮醛引起的HK-2细胞损伤作用的机制。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 细胞株

由中山大学中山医学院馈赠。

1.1.2 药品与主要试剂

6-姜酚（纯度＞98%）购自上海同田生物技术有限公司，丙酮醛（纯度＞95%）购自上海源叶生物科技有限公司，DCFH-DA（双氯荧光素）购自Sigma，SOD试剂盒购自南京建成公司，NF-κB抗体及β-actin抗体均购自Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 细胞内活性氧（ROS）水平检测

取对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔1000 μL，分为对照组、丙酮醛损伤组、丙酮醛+6-姜酚组及6-姜酚组。其中丙酮醛和6-姜酚处理浓度分别为400 μmol/L和200 μmol/L。细胞给予相应药物处理24 h后，加入1 μg/LDCFH-DA染色液，于37℃下避光孵育30 min，然后在荧光显微镜下观察，随机选取10个不重复区拍照。

1.2.2 HK-2细胞内SOD活力检测

将HK-2细胞接种于24孔板，每组设置4个复孔。按照实验分组加入药物处理24后。将细胞培养上清液收集到EP管中，300 0rpm/min，离心10 min后吸取上清。按照南京建成公司SOD检测试剂盒操作说明进行检测。

1.2.3 Western blot 法检测NF-κB蛋白表达水平

将HK-2细胞按相应密度接种于60 mm培养皿中，按实验分组加入药物处理。24h后去掉培养基，用预冷的PBS洗两遍，每皿加入100 μL细胞裂解液，在冰上裂解细胞，提取细胞总蛋白。每个泳道蛋白上样量为50 μg，电泳：恒压80V 30 min，100V 60 min。220 mA恒流转膜1h。用5%脱脂奶粉封闭1h后加入NF-κB抗体及β-actin抗体，β-actin作为内参。4℃摇床上孵育过夜，加入二抗。经曝光、显影及定影后，使用ImageJ软件分析条带的相应灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用“±s”表示，采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2细胞细胞内ROS水平的影响

DCFH-DA（2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐）本身没有荧光，进入细胞后可被水解生成DCFH，在活性氧存在的情况下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。如图1所示，对照组细胞内绿色荧光强度较弱，仅有少量ROS生成，而经400 μmol/L的丙酮醛处理后，细胞内绿色荧光强度明显增强，说明ROS水平明显升高；而加入6-姜酚共处理后，绿色荧光强度又显著减弱，明显抑制了丙酮醛诱导的ROS的生成。

图1 6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2细胞细胞内ROS水平的影响

2.2 6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2细胞细胞内SOD活力的影响

如图2所示，HK-2细胞经丙酮醛处理后的SOD活力明显降低，而加入6-姜酚共处理后，SOD活力明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2细胞细胞内NF-κB蛋白表达水平的影响

如图3所示，HK-2细胞经400 μmol/L的丙酮醛处理后，炎性细胞因子合成的关键转录因子NF-κB蛋白表达水平明显增高，而加入6-姜酚共处理后，NF-κB蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2细胞细胞内NF-κB蛋白表达水平的影响

3 讨 论

我国糖尿病发病率很高，总人数达9200万人，而随着全球范围内糖尿病患者人数的不断增加，糖尿病肾病发病率也会随之增高[2]。研究发现，丙酮醛是引起糖尿病组织细胞损伤的关键因素[3]。因此，寻求有效对抗丙酮醛损伤的药物是我们临床治疗糖尿病肾病的重要内容。我们先前报道干姜的主要活性成分——6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2肾小管上皮细胞具有保护作用，但机制尚未阐明。研究报道，6-姜酚可以通过抗氧化作用以及调节NF-κB对抗阿霉素引起的心肌细胞凋亡[1,4]。本研究结果显示，6-姜酚可以明显抑制丙酮醛引起的HK-2细胞内ROS的生成以及NF-κB蛋白的表达水平，并且提高细胞内SOD的活力。表明6-姜酚可能通过提高HK-2细胞的抗氧化应激能力及抑制NF-κB介导的炎症通路对抗丙酮醛引起的HK-2细胞损伤。本实验将为干姜在临床上的应用提供理论依据。

[1] Chen YL,Zhuang XD,Xu ZW,et al,Higenamine Combined with 6-Gingerol Suppresses Doxorubicin-Triggered Oxidative Stress and Apoptosis in Cardiomyocytes via Upregulation of PI3K/Akt Pathway,Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:970490.

[2] Yang W,Lu J,Weng J,et al,Prevalence of diabetes among men and women in China.N Engl J Med,2010,362(12):1090-101.

[3] Beisswenger PJ,Howell SK,Russell GB,et al.,Early progression of diabetic nephropathy correlates with methylglyoxal-derived advanced glycation end products.Diabetes Care,2013,36(10):3234-9.

[4] El-Bakly WM,Louka ML,El-Halawany AM,et al,6-gingerol ameliorated doxorubicin-induced cardiotoxicity:role of nuclear factor kappa B and protein glycation.Cancer Chemother Pharmacol,2012 Dec;70(6):833-41.

R285.5

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ISSN.2095-8242.2017.052.10111.03

国家自然科学基金资助项目（NO.：81560133）；贵州省科技合作计划项目（NO.：黔科合LH字[2015]7529号）；遵义医学院博士科研启动基金

陈燕玲，E-mail：546475534@qq.com

本文编辑：赵小龙