夹脊电针联合甲基强的松龙对ASCI大鼠脊髓组织NMDA受体亚单位NR1蛋白表达的影响*

李晓宁，吴 磊，覃业校，梁雪松，单筱淳，梅继林，李 诺

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

夹脊电针联合甲基强的松龙对ASCI大鼠脊髓组织NMDA受体亚单位NR1蛋白表达的影响*

李晓宁1，吴 磊2，覃业校1，梁雪松2，单筱淳2，梅继林2，李 诺2

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

目的:观察夹脊电针联合甲基强的松龙对急性脊髓损伤大鼠肢体运动功能评分及脊髓组织中N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位NR1蛋白表达的影响，探讨夹脊电针联合甲基强的松龙治疗ASCI的作用机制。方法:将72只雌性Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(ASCI)和夹脊电针联合甲基强的松龙组(EA+MP)，又分为1天、3天、7天和14天4个亚组，每个亚组6只。NYU打击器制备急性脊髓损伤大鼠模型。Sham组进行手术，不造模，术后常规饲养;ASCI组造模后常规饲养;EA+MP组造模后30 min，给予大鼠一次性注射甲基强的松龙30 mg/kg，术后3 h给予大鼠夹脊电针治疗，每次30 min，每日1次。采用BBB评分观察ASCI大鼠肢体运动功能，免疫组化法检测各组大鼠脊髓组织NMDA-NR1蛋白表达。结果:与Sham组比较，ASCI组大鼠BBB评分显著降低(P＜0.05);与ASCI组比较，经夹脊电针联合甲基强的松龙治疗3天后，EA+MP组BBB评分显著升高(P＜0.05)。与Sham组比较，ASCI组大鼠脊髓组织NMDA-NR1平均光密度值升高(P＜0.05);治疗3天后，与ASCI组相比，EA+MP组大鼠脊髓组织NMDA-NR1平均光密度值降低(P＜0.05)。结论:急性脊髓损伤后大鼠脊髓组织NMDA-NR1明显增高，夹脊电针联合甲基强的松龙治疗后NMDA-NR1显著下调，可能是其改善ASCI大鼠肢体运动功能的机制之一。

急性脊髓损伤;夹脊电针;甲基强的松龙;N-甲基-D-天冬氨酸受体

继发性损伤是急性脊髓损伤(ASCI)主要发病机制之一［1］，继发性损伤因其作用时间持久、作用机制复杂，往往造成更严重的脊髓损伤。兴奋性氨基酸毒性作用是ASCI继发性损伤的重要机制之一［2］，ASCI后微环境中兴奋性氨基酸大量聚集，谷氨酸作为递质释放后激活N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位NR1(NMDA-NR1)，从而导致神经细胞受损［3］。

ASCI目前临床尚缺乏有效的治疗手段，可供选择的手术治疗对严重的瘫痪没有明显的效果，药物治疗能够针对患者不同的症状分别营养神经、改善肌痉挛等，而神经干细胞治疗尚难以在临床广泛开展。临床及实验研究表明［4-7］，夹脊电针是治疗脊髓损伤的有效方法之一，针刺夹脊穴能够疏通督脉经气，而夹脊电针所形成的电场，能够促进脊髓损伤后神经细胞轴突再生。本研究拟从抑制ASCI后微环境中兴奋性氨基酸及其受体的角度，观察夹脊电针联合甲基强的松龙治疗对ASCI大鼠脊髓组织NMDA-NR1蛋白表达的影响，探讨其治疗ASCI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

将72只体质量为(200±10)g的健康清洁级雌性Wistar大鼠(购自辽宁长生生物技术有限公司，动物饲养许可证号2015-0001)，按照随机数字表法分为假手术组(Sham)、模型组(ASCI)和夹脊电针联合甲基强的松龙组(EA+MP)，每组又分为1天、3天、7天和14天4个亚组，每个亚组6只。按照课题组前期研究方法［8］，将符合模型制备成功标准的大鼠入组，保持室温恒定，大鼠单笼饲养，自由进食水。实验过程中对实验大鼠的处置遵照《关于善待实验动物的指导性意见》［9］中的相关规定。

1.2 试剂及仪器

山羊血清(SL2-10，中国，北京索莱宝科技有限公司);NMDA-NR1(BA0612，美国，博士德生物工程有限公司);生物素化山羊抗兔IgG(A0277，中国，上海碧云天生物技术有限公司);注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(H20030727，中国，国药);NYU打击器(Impactor Model-Ⅲ029，USA);电子脉冲治疗仪(KWD-808-Ⅱ，中国，常州英迪电子医疗器械有限公司);一次性无菌针灸针(0.35 mm×13 mm，中国，苏州华佗医疗器械有限公司)。

1.3 模型制备

实验大鼠用 10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，待大鼠完全麻醉后，固定于自制手术台上，背部备皮常规消毒，以大鼠T10棘突为中点，后背正中行约3 cm的纵行切口，距离T10上下各约1.5 cm，用手术刀沿棘突两旁切开皮下筋膜及肌肉组织，充分暴露T9～11棘突，用眼科手术镊钝性分离椎板和棘突上附着的肌肉组织，用眼科手术剪迅速剪断T9～11棘突，将T10后部椎板去除，重复暴露脊髓组织，手术过程中注意观察大鼠反应及脊髓形态，防止损伤脊髓。用NYU脊髓损伤打击器制备 ASCI模型［8，10］:将大鼠四肢和脊柱用相应的固定装置完全固定后，设置打击器参数，高度为50 mm，打击棒重量为10 g，迅速造成该段的急性脊髓中度损伤(50势能)，打击成功后打击器会发出警报声，电脑描记出相应的撞击曲线，移开打击棒可见大鼠硬脊膜充血。然后用生理盐水冲洗伤口，分层缝合伤口，注意大鼠术后保暖，并从术后第2天开始每天轻柔挤压大鼠膀胱2次，以协助大鼠排尿，防止形成尿潴留。

1.4 干预方法

1.4.1 假手术组(Sham) 仅进行手术，不造模，术后常规饲养。

1.4.2 模型组(ASCI) 造模后常规饲养。

1.4.3 夹脊电针联合甲基强的松龙组(EA+MP)

按照课题组前期研究方法［8］，模型制备成功后给予夹脊电针和甲基强的松龙腹腔注射联合治疗，具体操作如下:甲基强的松龙治疗:术后30 min时，给予实验大鼠一次性注射甲基强的松龙(1.2 mg/ml)，按30 mg/kg剂量给予大鼠腹腔注射。夹脊电针治疗:于模型制备成功后3 h给予实验大鼠夹脊电针治疗，将大鼠固定于自制鼠板上，选择T9、T11节段夹脊穴，用0.35 mm×13 mm规格一次性无菌针灸针，直刺进针约4～5 mm，然后同侧夹脊穴分别接电针仪，上正下负，选择密波，频率为100 Hz，电流大小以大鼠耐受为度，刺激时长为30 min/次·日-1，每日1次。

1.5 大鼠BBB运功功能评分

BBB评分［11］是目前使用最为广泛的脊髓损伤大鼠肢体运动功能评分方法之一，在实验操作过程中，选择3名经过培训的实验人员，每天早晨相同时间段将大鼠放置在固定大小的平台上，3位实验人员同时观察各组大鼠的髋、膝、踝3个关节的活动情况，及大鼠活动时的协调性，分别给出分数，求其平均值，得出该实验大鼠肢体运动功能评分分数。

1.6 免疫组化法检测脊髓组织中NMDA-NR1蛋白表达

大鼠治疗后，用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，大鼠完全麻醉后迅速断头处死，取出以损伤点为中心的一段长度约为4 cm的脊髓组织，置于4%多聚甲醛缓冲液中固定，4℃保存备用。制备石蜡切片，层厚5 μm。免疫组化:取制备好的石蜡切片，经过梯度酒精脱蜡至水，微波炉中对组织进行抗原修复10 min，分别加入一抗和二抗孵育，PBS完全漂洗后分别加入辣根酶标记，并进行DAB显色，每张组织切片选取5个高倍镜下视野(400×)采集图像，使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对有阳性表达的组织切片图像进行平均光密度(density mean)测定并计算每张切片的平均值，记录各组数据进行分析。

1.7 统计学处理

2 实验结果

2.1 夹脊电针联合甲基强的松龙对ASCI大鼠肢体运动功能评分的影响

BBB评分结果显示，假手术组(Sham)大鼠肢体运动功能评分正常，模型组(ASCI)大鼠肢体运动功能评分较假手术组(Sham)显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。治疗3天后，夹脊电针联合甲基强的松龙组(EA+MP)大鼠肢体运动功能评分升高，与模型组(ASCI)比较差异显著(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠运动功能评分比较(±s，6只鼠/组)

表1 各组大鼠运动功能评分比较(±s，6只鼠/组)

注:与 Sham 组比较，#P ＜0.05;与 ASCI组比较，*P ＜0.05

1 d 3 d 7 d 14 d Sham 组 21.00 ±0.00 21.00 ±0.00 21.00 ±0.00 21.00 ±0.00组别ASCI组 1.08 ±0.22# 1.12 ±0.15# 2.36 ±0.27# 4.25 ±1.02#EA+MP 组 1.26 ±0.15# 3.66 ±1.52#*6.74 ±0.72#* 12.05 ±1.62#*

2.2 夹脊电针联合甲基强的松龙对 ASCI大鼠NMDA-NR1蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，NMDA-NR1主要表达于胞浆。模型组(ASCI)NMDA-NR1平均光密度值升高，且3天时达到高峰，此后逐渐下降，术后各时间点与假手术组(Sham)比较差异显著(P＜0.05)。治疗3天后，与模型组(ASCI)相比，夹脊电针联合甲基强的松龙组(EA+MP)NMDA-NR1平均光密度值降低，差异显著(P＜0.05)。见表2、封三彩图1。

表2 各组大鼠NMDA-NR1的表达(IOD/AREA 10-3，±s)

表2 各组大鼠NMDA-NR1的表达(IOD/AREA 10-3，±s)

注:与 Sham 组比较，#P ＜0.05;与 ASCI组比较，*P ＜0.05

6 2.39 ±0.79 2.28 ±0.71 2.26 ±1.25 2.09 ±0.76 ASCI组 6 7.73 ±1.02#20.38 ±3.82#16.78 ±2.94# 9.14 ±1.27#EA+MP 组 6 7.29 ±1.91#13.95 ±2.99#*6.47 ±2.43#* 2.47 ±1.90#*1 d 3 d 7 d 14 d Sham组组别 n

3 讨论

急性脊髓损伤属于祖国传统医学“痿证”范畴，可由督脉受损所致，督脉为人体阳气之海，督脉受损则阴阳和气血失调，阳气和气血无法到达肢体远端，日久而致肢体萎软无力。督脉附近有足太阳膀胱经，该经为多气多血之经，对调节人体气血盛衰具有重要作用，夹脊穴内夹督脉，外循膀胱，针刺可以通调一身之阳气和气血。夹脊电针则是在针刺夹脊穴的基础上通以脉冲电流，在受损脊髓节段形成电场，使神经细胞的轴突沿着电场方向再生。本课题组前期研究已证实夹脊电针治疗脊髓损伤的有效性［12］，结果发现，夹脊电针治疗能够提高脊髓损伤患者治疗前后ASIA和改良的Barthel指数量表评分，降低Ashworth指数量表评分，从而改善脊髓损伤患者日常生活活动能力，并改善肌痉挛。

神经细胞微环境中适量浓度的兴奋性氨基酸对维持细胞正常的生理功能起着重要作用，谷氨酸(Glu)即是一种常见的兴奋性氨基酸。在正常情况下，谷氨酸释放后能够激活其受体NMDAR，NMDA受体具有调节突触传递、突触可塑性及长时程突触增强形成［13］的功能，其对钙离子高度通透，因此推测该受体在谷氨酸引起的兴奋性毒性作用中具有重要地位。当脊髓损伤后，组织缺血缺氧，突触间隙中谷氨酸浓度升高，谷氨酸激活NMDA受体增加细胞膜的通透性，并且能够通过使细胞外的Ca2+大量内流，激活其下游一系列蛋白酶，引起神经细胞肿胀和坏死，使脊髓损伤进一步加重。王建设等［14］研究发现，ASCI后大鼠脊髓背角浅层存在NR-1高表达，可能参与了ASCI后多种病理过程的发生、发展。曹晓建等［15］发现，NR-1在正常大鼠组织中几乎不表达，而在ASCI大鼠中大量表达。由此可见，NMDA-NR1的异常表达参与了脊髓继发性损伤的发生，夹脊电针联合甲基强的松龙治疗脊髓损伤临床疗效确切，其是否通过调控脊髓损伤后NMDA-NR1的表达发挥神经保护作用尚有待阐明，本研究结果显示，Sham组可见少量NMDA-NR1表达;ASCI组NMDA-NR1蛋白表达较Sham组增加，差异显著(P＜0.05)，造模后3天达到表达高峰，此后开始逐渐下降，可能是由于内源性保护机制被激活。EA+MP组治疗3天后，NMDA-NR1蛋白表达明显低于ASCI组(P＜0.05)。以上结果表明，脊髓损伤后NMDA-NR1蛋白表达增加，而给予EA+MP治疗后可以抑制脊髓损伤后NMDA-NR1蛋白表达，从而发挥神经保护作用，促进肢体运动功能恢复，这一结果与BBB评分相一致。

综上所述，夹脊电针联合甲基强的松龙治疗可以显著抑制因急性脊髓损伤导致的NMDA-NR1蛋白过度表达，从而减轻微环境中兴奋性氨基酸毒性，这可能是其改善ASCI大鼠肢体运动功能的作用机制之一。

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Protein Expression of NMDA-NR1 in Spinal Cord Tissue of ASCI Rats Intervened by Jiaji Electro-acupuncture Combined with Methylprednisolone

LI Xiao-ning1，WU Lei2，QIN Ye-xiao1，LIANG Xue-song2，SHAN Xiao-chun2，MEI Ji-lin2，LI Nuo2
(1.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150001，China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To observe the effect of Jiaji electro-acupuncture combined with Methylprednisolone on the scores of limb motor function and the expression of N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR1(NMDAR-NR1)of spinal cord tissue in ASCI(acute spinal cord injury)rats，and to explore the mechanism of this therapy for ASCT.Methods:72 Wistar rats(male)were randomly divided into the sham group(group A，n=24)，the model group(group B，n=24)，and Jiaji electro-acupuncture combined with Methylprednisolone group(group C，n=24);each group was subdivided into four subgroups according to 1 d，3 d，7 d and 14 d，with 6 rats in each group.ASCI models were established with NYU striker.The rats in group A were applied with sham operation without modeling followed by conventional breeding;the rats in group B were modeled followed by conventional breeding;whereas，the rats in group C were given one-time injection of Methylprednisolone(30 mg/kg)30min after modeling，Jiaji electro-acupuncture was applied 3h after the surgery(30 min/time，once per day).The limb motor function was observed by evaluating the scores of BBB，and the expression of NMDA-NR1 was detected by immunohistochemistry.Results:In term of scores of BBB，it was significantly reduced in group B than that in group A(P ＜0.05);however，it was remarkably increased after three-day treatment in group C compared to that in group B(P ＜0.05).In terms of NMDA-NR1 expression，it was significantly increased in group B compared to that in group A(P ＜0.05);but it was obviously decreased after three-day treatment in group C compared to that in group B(P ＜0.05).Conclusion:NMDA-NR1 may significantly increased in ASCI rats，and the therapy of Jiaji electro-acupuncture combined with Methylprednisolone can down-regulate NMDA-NR1，which may be one of its mechanisms to improve limb motor function in ASCI rats.

Acute spinal cord injury;Jiaji electro-acupuncture;Methylprednisolone;NMDAR

R246.2

A

1005-0779(2017)10-0060-04

国家自然科学基金项目，编号:81373715;哈尔滨市应用技术研究与开发项目科技创新人才类(优秀学科带头人B类)项目，编号:2016RAXYJ090。

李晓宁(1969-)，女，教授，博士研究生导师，研究方向:针灸治疗神经系统疾病。

2017-05-15