HY5通过PIF4基因控制高温诱导的拟南芥下胚轴伸长反应

郑兰兰　李琛　张璟璇

摘要：考察了拟南芥野生型、hy5、pif4及hy5pif4双突变体在22 ℃和30 ℃培养下的下胚轴伸长表型；利用qRT-PCR监测PIF4基因在野生型和hy5突变体30 ℃处理后持续多个时间点的动态表达。结果表明，HY5通过抑制下游基因PIF4调控高温诱导的下胚轴伸长。PIF4：：GUS启动子融合报告基因株系的染色结果表明，高温对PIF4轉录水平的诱导主要发生在子叶而不是下胚轴。通过qRT-PCR检测PIF4同源基因PIF5，生长素合成基因YUC2、YUC3、YUC8和生长素反应基因IAA29在野生型和hy5突变体的动态表达，HY5通过调控PIF4介导的生长素通路来控制拟南芥下胚轴的伸长反应。

关键词：拟南芥（Arabidopsis thaliana）；HY5；PIF4；生长素；高温；下胚轴

中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）18-3554-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.041

Abstract： Hypocotyl phenotype of wild type，hy5，pif4 and hy5pif4 were examined under 22 ℃ and 30 ℃. qRT-PCR was performed to compare PIF4 expression dynamics during the time course after heat treatment in wild type and hy5 mutant. The expression level of PIF4 was increased in hy5 mutant，suggesting that HY5 repress PIF4 to regulate hypocotyl elongation. Tissue level analysis of PIF4：：GUS promoter reporter indicates that high temperature induced expression of PIF4 occurred in cotyledon but not hypocotyl. Moreover，PIF4 homolog gene PIF5，auxin synthesis genes YUC2，YUC3，YUC8，and auxin response gene IAA29 were upregulated in hy5 mutant when compare to wild type during the time course after high temperature treatment. These suggest HY5 regulate PIF4 mediated auxin pathway to control hypocotyl elongation under high temperature condition.

Key words： Arabidopsis； HY5； PIF4； auxin； high temperature； hypocotyl

随着全球环境温度的升高，有必要了解和研究植物反应和适应环境变化的机制。光和温度是植物生长和发育中不可或缺的两类重要的环境因子。为了应对光和温度环境的变化，植物表现出高度的可塑性。下胚轴的伸长反应是植物细胞伸长和可塑性的关键表型[1-3]。幼苗的下胚轴在暗培养下显著伸长，在光照下伸长被抑制。基于光、暗两种生长条件下幼苗形态的差异，通过筛选在暗下保留光形态建成特征的拟南芥突变体，克隆CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC/DE-ETIOLATED/FUSCA（COP/DET

/FUS）的位点[4，5]。相关突变体如cop/det/fus突变体在暗培养下都呈现去黄化的表型。这些位点编码的蛋白大多数属于一个大分子复合体COP9 signalosome（CSN）的某个组分[3，6-8]。CSN复合体调控光反应激活子（通常是转录因子）的26S蛋白酶介导的降解路径[7]。通过筛选在光下保留暗形态建成特征（主要是下胚轴伸长）的突变体，鉴定了多个Long hypocotyls（HY1 to HY8）的遗传位点。它们中有光信号受体（HY1、HY3/PHYB、HY8/PHYA、HY4/CRY1）以及下游信号因子（比如HY5）等[8-13]。hy5编码bZIP转录因子，是第一个被克隆的光形态建成激活子[14]。hy5突变体在光照下有较长的下胚轴[14]，是研究下胚轴伸长反应的重要遗传材料。

高温（30 ℃）可以诱导下胚轴的伸长[1]，但是生长素反应和极性运输途径缺失的突变体对高温诱导不敏感，而赤霉素（GA）、乙烯等合成缺失的突变体对高温诱导效应影响不大[1]。外源施加GA合成抑制剂（Paclobutrazol，PAC）和生长素极性运输剂（1-naphthylphthalamic acid，NPA）都可以抑制高温诱导的下胚轴伸长[15]，这表明生长素参与高温诱导的下胚轴伸长。PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4（PIF4）是Phytochrome B信号通路的负调控因子并受高温迅速诱导[16]。pif4缺失突变体对高温不敏感[17]，PIF4介导的依赖于YUCCA8（YUC8）的生长素合成途径被发现是高温诱导下胚轴伸长的主要机制[18-20]，高温诱导下胚轴伸长的分子机制仍有待更深入的研究[21]。针对转录因子HY5的全基因组水平的染色质免疫共沉淀芯片（CHIP-chip）鉴定出超过3 000个可能的HY5转录结合的下游基因[22]，这其中包括PIF4[22，23]，暗示HY5与PIF4之间存在遗传互作。endprint

研究突變体在高温下的表型，发现hy5突变体下胚轴比野生型伸长更显著，而hy5pif4双突变体的下胚轴伸长比hy5突变体短。通过qRT-PCR检测PIF4基因的表达水平，PIF4受高温诱导表达的程度在hy5突变体中比野生型高。通过对PIF4：：GUS报告基因株系组织特异性表达的研究，发现温度诱导的PIF4转录水平上调主要发生在子叶。PIF4的同源基因PIF5，生长素合成基因YUC2、YUC3、YUC8以及生长素反应基因IAA29的表达量在hy5突变体中都比野生型高，表明HY5调控PIF4介导的生长素合成和信号通路。

1 材料与方法

1.1 植物材料与生长条件

拟南芥野生型Columbia （Col）、hy5 （SALK_05

6405）、pif4（N66043_SAIL_1288_E07）及通过杂交获得的hy5pif4双突变体。

拟南芥的种植条件和方法：①种子消毒，用15%漂白水稀释液浸泡种子15～20 min，而后用无菌水漂洗3～4次。②消毒后的种子放置于4 ℃冰箱避光处理1～3 d，以实现低温诱导种子整齐萌发。③将种子种在1/2 MS固体培养基，置于光照件下培养。培养温度为22或30 ℃。

1.2 下胚轴长度测量和分析

用相机拍下对应天数的幼苗生长照片，利用ImageJ（http：//rsb.info.nih.gov/ij/）进行数据测量。

1.3 qRT-PCR基因表达分析

样品取自生长6 d的幼苗地上部分，包括子叶和下胚轴。RNA的抽提使用的是Tranzol（Transgene，北京全式金生物技术有限公司），试验步骤按照说明书进行。qRT-PCR反应体系按照SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）提供的说明书配制。PCR反应在公司的ABI 7500 Real-time PCR system（Applied Biosystems）上进行。Elongation Factor 1α（EF1α）作为内参。引物序列见表1。

1.4 质粒克隆和植物转化

PIF4：：GUS是PIF4启动子驱动的报告基因为GUS的转基因植株。启动子选择的区段为起始密码子ATG往上选取至上游基因为止的3.8 kb序列，然后克隆到融合GUS报告基因的pGreenII-0229双元载体上。引物序列见表1。拟南芥的转化采用花序浸染法[24，25]。

1.5 GUS染色和强度分析

染色分析参考文献[26]。将待测试材料浸泡在GUS染液里，37 ℃培养，直到充分染色即可。利用ImageJ（http：//rsb.info.nih.gov/ij/）进行GUS染色强度的定量分析。

2 结果与分析

2.1 突变体在20 ℃和30 ℃的下胚轴表型

在20 ℃光照培养条件下，hy5突变体下胚轴比野生型长[14]，而pif4下胚轴比野生型稍短[17]（图1）。hy5pif4双突变体表型分析发现双突变体的下胚轴长度介于两个亲本之间，即双突下胚轴比hy5短，表明PIF4基因有可能位于hy5的下游。

在30 ℃光照培养条件下，所有材料的下胚轴都比20 ℃时长，但是hy5相比野生型伸长更为显著，而hy5pif4双突变体对高温诱导反应的敏感度降低（图1）。表明HY5是高温诱导下胚轴伸长的抑制因子，而它的抑制作用一定程度上是通过PIF4作用的。

2.2 PIF4和YUC8基因表达水平的检测

突变体表型分析表明PIF4位于hy5的下游。检测PIF4基因在野生型和hy5突变体受高温诱导后不同时间点的动态表达情况。结果表明，在野生型里PIF4的表达量被高温持续诱导，但在hy5突变体里PIF4在每个时间点的表达量都比野生型高（图2），表明HY5是PIF4的转录抑制因子。

PIF4依赖的YUC8表达水平升高和生长素合成的增加是高温诱导下胚轴伸长的一个重要分子机制[19]，检测YUC8在高温诱导中的动态表达情况。与PIF4一致，YUC8在hy5突变体里的表达持续高于同时间点处理的野生型（图2）。结果表明，HY5通过影响PIF4基因依赖的YUC8表达和生长素合成调控下胚轴的高温诱导伸长反应。

2.3 PIF4：：GUS启动子融合株系在高温诱导中的表达模式分析

PIF4是关键的高温诱导促进因子[17，19，20]，但是其在高温诱导过程中的表达模式并不清楚。因此，构建了PIF4：：GUS启动子融合报告基因株系，并观察了在高温诱导过程中GUS表达的强度变化（图3）。高温诱导4 h后，子叶的GUS染色强度开始显著增强，并保持持续增强的趋势，而下胚轴的GUS染色强度没有显著改变（图3）。结果表明，高温诱导的PIF4转录水平累积主要集中在下胚轴。

2.4 生长素合成及响应基因的表达变化

根据已发表的CHIP-chip结果[22]，PIF4及同源基因PIF5是可能的hy5下游基因。同时，下胚轴的伸长与PIF4调控的生长素合成途径如YUC8及其同源基因YUC2和YUC3相关[27]。生长素反应因子如IAA29的表达水平反映体内生长素的分布情况。IAA29的表达也被高温诱导[17]。基于此，检测了这些基因在高温诱导过程中的表达变化，发现它们的表达在hy5突变体里持续升高（图4）。

3 讨论

PIF4调控高温对下胚轴伸长的诱导反应主要是通过影响生长素的合成和响应反应来实现的[19]。HY5是光形态建成的重要促进因子，但其在高温诱导下胚轴伸长过程中的调控机理研究并不多。PIF4是假定的hy5下游靶基因[22]。

结果表明，HY5是拟南芥响应光和温度的共同调控因子。HY5位于PIF4介导的生长素调控网络的上游。有研究通过正向遗传学的方法筛选对高温诱导不敏感的突变体鉴定了DE-ETIOLATED 1（DET1）的等位突变体okapi1，通过同样的遗传杂交分析等手段证明光和高温都通过DET1-COP1-HY5途径调控PIF4[28]。endprint