不同试验因素对口蹄疫病毒TCID50的影响

郝志怡

摘要：试验用单层法和同步法2种方法，用不同细胞密度及稀释体系对同种口蹄疫病毒的毒价进行了测定。结果表明，细胞密度对口蹄疫病毒毒价的测定没有直接影响，而病毒稀释体系越大，结果越稳定，测得的毒价越高，且纤维细胞较仓鼠肾细胞对口蹄疫病毒更为敏感。

关键词：口蹄疫；细胞；病毒毒价；滴定

中图分类号：S855.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）010-0009-02

口蹄疫病毒属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，是RNA病毒中最小的一个，也是最早能在组织上培养的病毒之一。与其他小RNA病毒相似，口蹄疫病毒在感染4～6 h后，形成的感染性病毒粒子会导致细胞病变。在体外试验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，一段时间后用显微镜可观察到细胞变圆，坏死，从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用。利用此种病变效应可进行病毒定量。

目前，一般用滴定法测定口蹄疫灭活疫苗的毒价。在检验疫苗效力時，常用细胞微量中和试验来检测免疫动物体内抗体效价的高低，从而判定疫苗效果。其中，病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键。本试验用2种不同方法对TCID50滴定试验中细胞密度、病毒稀释体系2种因素进行研究，进一步确认这些因素对口蹄疫病毒TCID50的测定是否有影响，以获得准确、稳定的口蹄疫病毒毒价测定方法，为今后的试验提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

DMEM培养基，pH 7.2的PBS缓冲液，0.25%胰酶-EDTA，小牛血清，滴定用口蹄疫病毒。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从液氮罐中取出含BHK-21细胞（仓鼠肾细胞）或纤维细胞的冷冻管，37 ℃水浴1 min使其完全融化，取出细胞；将细胞接种到110 cm2细胞培养瓶中，加适量培养液及小牛血清，接种浓度1×109个/L，置37 ℃恒温箱静置培养，次日更换培养液，观察生长情况。48 h后弃除旧培养液，用PBS缓冲液冲洗2遍，加入2 mL胰酶消化液消化2 min左右，可看到细胞像沙子一样脱落，加10 mL含 6%的小牛血清培养液终止消化，用吸管吹吸细胞，制成细胞悬液，再加适量含 6%的小牛血清培养液，调整细胞浓度，继续培养，连续传代。

1.2.2 细胞计数 取0.1 mL细胞悬液，加到细胞计数板的盖玻片下，显微镜下40倍观察计数。当活细胞数大于95%，用含6%牛血清DMEM培养液将细胞稀释成所需浓度。

1.2.3 单层法

（1）取生长良好的细胞，依细胞传代方法，制备细胞悬浮液，用6%的DMEM调整细胞浓度，以1.5×105个/mL和3.2×105个/mL加入到96 孔微量培养板。每孔100 μL（1.5×104个/孔、3.2×104个/孔）。

（2）将培养板置于CO2培养箱，温度（36±2） ℃， 培养18～24 h。经过24 h后有70%～90%细胞融合，进行单层滴定。

（3）取出样品和滴定用口蹄疫病毒，完全解冻后，振荡样品2～5 s，用移液器吸取0.2 mL或0.5 mL样品到第一只试管中，振荡后转移0.2 mL或0.5 mL到下一管中，以此类推，直到最后一个稀释度。

（4）取出96孔板细胞，标记样品批号和稀释度，弃掉细胞培养液。由最稀到最浓的稀释度顺序接种，每个稀释度接种8孔，每孔100 μL，每个稀释度需更换枪头。将96孔板放入（36±2） ℃的CO2培养箱中培养5～6 d，直到最后判定结果。

1.2.4 同步法 方法同“1.2.3”，区别是将培养板置于CO2培养箱，温度（36±2） ℃， 静置30～60 min，待细胞沉降吸附在细胞板上后进行同步滴定。

2 结果与分析

单层法（纤维细胞）试验中当细胞密度为3.2×105个/mL时，病毒稀释体系5.0 mL测得的口蹄疫病毒毒价为106.375TCID50/mL；病毒稀释体系2.0 mL时测得的口蹄疫病毒毒价为105.375TCID50/mL。当细胞密度为1.5×105个/mL时，病毒稀释体系5.0 mL测得的口蹄疫病毒毒价为106.375TCID50/mL；病毒稀释体系2.0 mL测得的口蹄疫病毒毒价为105.5TCID50/mL。

同步法（仓鼠肾细胞）试验中当细胞密度为3.2×105个/mL时，病毒稀释体系5.0 mL测得的口蹄疫病毒毒价为105.625TCID50/mL；病毒稀释体系2.0 mL测得的口蹄疫病毒毒价为104.875TCID50/mL。当细胞密度为1.5×105个/mL时，病毒稀释体系5.0 mL测得的口蹄疫病毒毒价为105.25TCID50/mL；病毒稀释体系2.0 mL测得的口蹄疫病毒毒价为104.875TCID50/mL。

3 讨论

试验中常用平行试验来减少误差，保证测定结果的准确性，不同细胞对口蹄疫病毒的吸附能力不同，而病毒稀释体系的大小也会影响测定结果。本试验用单层法和同步法2种方法，通过用不同细胞密度及稀释体系对同种口蹄疫病毒的毒价进行测定，结果显示，细胞密度对口蹄疫病毒毒价的测定没有直接影响，而病毒稀释体系越大，结果越稳定，测得的毒价越高，且纤维细胞较仓鼠肾细胞对口蹄疫病毒更为敏感。这一结果为以后的中和试验提供了依据，也为测定口蹄疫疫苗抗体效价奠定了基础。endprint