基于CV-1细胞雌激素受体报告基因试验方法建立及双酚A类似物雌激素效应的检测

范德玲, 吉贵祥, 杨先海, 汪 贞, 王 蕾, 刘济宁, 石利利

(环境保护部南京环境科学研究所， 江苏 南京 210042)

基于CV-1细胞雌激素受体报告基因试验方法建立及双酚A类似物雌激素效应的检测

范德玲, 吉贵祥, 杨先海, 汪 贞, 王 蕾, 刘济宁①, 石利利

(环境保护部南京环境科学研究所， 江苏 南京 210042)

以荧光素酶为报告基因，通过雌激素反应元件调控的带有荧光素酶报告基因质粒pERE-TATA-Luc和雌激素受体表达质粒rERa/pCI，采用瞬时共转染方法，将Luc报告基因质粒和受体表达质粒共转染至非洲猴肾CV-1细胞，以雌二醇作为阳性对照物，其浓度为10-10mol·L-1时显著诱导荧光素酶的表达，浓度为10-9mol·L-1时达最大值，半数效应浓度EC50值为6.1×10-11mol·L-1。通过雌二醇、己烯雌酚和木黄酮检测系统的灵敏性、有效性和稳定性验证，建立实验室稳定、灵敏的雌激素受体报告基因细胞系。基于非洲猴肾CV-1细胞受体报告基因试验，研究双酚A类似物拟雌激素干扰活性，雌激素活性大小顺序为BPAF > BPF > BPB > BPA > BPZ > BPAP > BPS > BPP。结果表明，CV-1细胞受体报告基因试验是一种筛选雌激素活性内分泌干扰物的快速、有效的方法。

双酚A类似物； 雌激素效应； 体外试验

双酚A(bisphenol A,BPA) 是一种典型的环境内分泌干扰物,被广泛应用于日用品生产中[1],在食物、水、车间空气以及人类尿液、血液、母乳中都有检出[2]。研究表明,BPA具有内分泌干扰效应等毒性效应,会对人体健康造成一定危害,包括出生缺陷、癌症和早熟等系列健康问题[3-5],BPA暴露的健康危害已经引起社会的广泛关注[6-10]。鉴于此,加拿大、法国、欧盟等国家和地区已经开始限制含BPA塑料制品的使用,尤其是对婴幼儿等敏感人群[11-12]。为了应对管制措施,一些BPA类似物被开发用来替代BPA,其中常见的有双酚B(bisphenol B,BPB)、双酚AF(bisphenol AF,BPAF)、双酚F(bisphenol F,BPF)、双酚S(bisphenol S,BPS)、双酚AP〔4,4′-(1-Phenylethylidene) biphenol,BPAP〕、双酚Z(bisphenol Z,BPZ)和双酚P(bisphenol P,BPP)。

研究表明,BPA类似物不仅对生物具有急、慢性毒性效应,而且具有内分泌干扰毒性效应。STOUT[13]对未发育完全的雌性大鼠连续3 d皮下注射 100 mg·kg-1BPAF后,发现其子宫大小比正常大鼠增大337%。LI等[14]通过荧光素酶报告基因研究BPAF的转录活性,发现BPAF可以通过基因和非基因途径激活人的乳腺癌细胞,从而刺激内源性雌激素响应基因的转录。CABATON等[15]通过体外人体细胞系和彗星试验研究发现,BPF对人体细胞系尤其是HepG2细胞的基因毒性和内分泌活性远远高于4,4′-二羟基二苯甲酮(DHB)和羟基化BPF(BPF-OH),并且在10-5mol·L-1时就具有抗雄激素效应。SONG等[16]以斑马鱼的胚胎和幼鱼为模式生物研究四溴双酚A (TBBPA)、四氯双酚A (TCBPA)和BPAF这3种卤代双酚A类似物的发育毒性,半致死浓度值LC50的计算结果表明其毒性大小为TCBPA> TBBPA> BPAF,3种物质均会导致胚胎和幼鱼的发育病变,如延迟孵化、水肿和出血等,通过体内卵黄蛋白原(vtg)测定和体外MVLN试验发现,BPAF表现出比BPA更强的雌激素效应。

研究表明,由于内分泌干扰物(BPA)与某些生物体内激素的结构相似,可能与激素受体蛋白结合,形成配体-受体复合物,再与DNA结合区的反应元件结合,影响人和动物的内分泌系统;内分泌干扰物可以与生物体内的激素相互竞争结合,从而减少受体与生物体内的激素结合,影响激素信号在细胞、器官和组织中的传递,导致机体功能失调[17]。受体报告基因试验是美国环保署(USEPA)推荐的体外检测方法之一,以受体介导为基础,应用基因重组技术,将报告基因置于外源性激素反应元件调控之下,构建重组报告基因质粒,应用基因转染技术导入哺乳动物细胞内,通过检测报告基因编码的酶活性或蛋白表达的变化,间接反映环境内分泌干扰物(EDCs)作用下内源性基因的表达情况。

目前针对BPA类似物内分泌干扰效应的报道还较少,笔者开展基于非洲猴肾细胞(CV-1)核受体介导的报告基因试验,研究BPA类似物对雌激素受体的干扰作用,为BPA类似物内分泌干扰效应的生态风险评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与质粒

CV-1细胞购于中国医学科学院上海分院细胞研究所;pERE-TATA-Luc和rERa/pCI 为日本Takeyoshi Masahiro 博士馈赠,感受态E.Colo Ⅰ DH5a购于北京全式金生物实验技术有限公司。

1.2 仪器与试剂

CO2培养箱为美国Thermo C0150产品,超净工作台为三德医疗器械(南京)有限公司产品,台式高速低温离心机为上海翼控机电有限公司产品,Berthold LB960化学发光检测仪为德国Berthold公司产品,超微量分光光度计购自美国Quawell公司,24孔板、细胞冻存管为美国康宁公司产品,青霉素-链霉素溶液、Ampicilin和质粒提取试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品,无酚红DMEM培养基、胎牛血清为美国Gibco公司产品,Sofast 转染试剂购自太阳马生物工程有限公司,萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒购自碧云天公司;雌二醇(AR,w=98.0%)、己烯雌酚(AR,w=99.0%)、木黄酮(AR,w=99.0%)、双酚A(w=98.5%)、双酚B(w>98.0%)、双酚S(w>98.0%)、双酚Z(w=98.0%)、双酚AF(w=98.0%)、双酚F(w>99.0%)、双酚P(w=99.0%)、双酚AP(w>98.0%)均购于百灵威(上海)化学技术有限公司,乙醇购于南京化学试剂有限公司。

1.3 质粒的获取与鉴定

将pERE-TATA-Luc和rERa/pCI转化至E.Colo Ⅰ DH5a,37 ℃正面培养1 h后倒置培养过夜。挑选LB平板形成的阳性单菌落接种到含50 μg·mL-1氨苄青霉素(AMP)的LB培养基中扩增,以280 r·min-1振荡培养12 h,应用质粒提取试剂盒提取质粒,通过DNA序列测定对比分析鉴定重组质粒基因的正确性,并测定浓度。

1.4 质粒转染CV-1细胞

CV-1细胞用DMEM培养基(青、链霉素各100 μg·mL-1,庆大霉素50 μg·mL-1,φ=10%的胎牛血清,pH值7.1),在37 ℃、φ=5%的CO2培养箱中进行培养,当细胞生长至80%满瓶时,用2.5 g·L-1胰酶〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化液消化细胞,用不含酚红的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)重悬,按每孔105细胞量接种到24孔板中,培养液的加入量为0.5 mL,在37 ℃、φ=5%的CO2培养箱中培养12 h,使细胞密度达70%～80%。

通过核酸测定仪测定质粒浓度,取0.5 μg pERE-TATA-Luc和0.2 μg rERa/pCI稀释于30 μL PBS缓冲液中,轻轻混匀后,作为A液;取1 μL Sofast转染试剂稀释于30 μL PBS缓冲液中,轻轻混匀后,作为B液;将B液滴加到A液中,边滴加边涡旋,充分混匀,作为A+B混合液,室温孵育20 min;轻轻摇动后,将A+B混合液滴加到24孔板中,混合液与培养基均匀混合后,在37 ℃、φ=5%的CO2培养箱中培养12 h后,加入受试物进行染毒。

1.5 受试物染毒

吸去24孔板中的转染液,加入不同剂量的雌二醇(E2)、乙烯雌酚、木黄酮,浓度范围为10-12～10-8mol·L-1,10倍浓度间隔;双酚A、双酚B、双酚S、双酚Z、双酚AF、双酚F、双酚P和双酚AP浓度范围为10-7～10-4mol·L-1,1.1倍浓度间隔,以φ=0.1%的无水乙醇作为空白对照,各剂量均设3个复孔,检测荧光酶活性,以3次荧光素酶诱导倍数的平均值作为各处理组Luc荧光值,通过剂量-效应曲线计算半数有效浓度EC50。

通过10-9mol·L-1的E2在同一板内、不同板间、多代细胞(3代和20代)的诱导作用进行重复性试验。

1.6 细胞裂解及报告基因检测

吸去24孔板中的培养液,用PBS 1×缓冲液洗细胞2次,用枪头将PBS吸干净,尽量不丢失细胞;每孔加入1×被动裂解缓冲液(PLB) 200 μL,轻轻晃动培养板保证所有的细胞都被覆盖;室温下,在脱色摇床上轻轻晃动培养板,孵育15 min;用枪头轻刮培养板的表面,倾斜培养板,将细胞完全刮到培养板的低处,将细胞裂解液转移到1.5 mL离心管中,旋涡混匀10～15 s;4 ℃条件下,以相对离心力12 000 g离心2 min,将上清液转移到另一干净的离心管中;采用专用96孔非透明板,每孔加入100 μL细胞裂解液和100 μL荧光素酶检测试剂,混匀,采用化学发光检测仪检测。

1.7 统计分析

Luc诱导活性以受试物的Luc表达相对于溶剂对照组Luc表达的倍数表示,Luc诱导倍数=染毒组Luc值/溶剂对照组Luc值。

2 结果与分析

2.1 质粒的鉴定结果

5′-G-G-T-A-C-C-A-A-A-G T-C-A-G-G-T C-A-C-A -G-T-G-A-C-C-T-G-A-T C-A-A-A-A-G-T-C-A-G- -G-T-C-A-C-A-G-T-G-A-C-C-T-G-A-T-C-A-A-A A-G-T-C-A-G-G-T-C-A C-A-G-T-G-A-C-C-T-G A-T-C-A-G-A-G-C-T-C-3′为报告基因重组质粒pERE-TATA-Luc的引物,质粒扩增之后,通过DNA序列鉴定重组质粒基因序列的正确性(匹配度=100%),结果如图1所示。

受体表达质粒rERa/pCI经质粒扩增之后,通过DNA序列鉴定重组质粒基因序列的正确性(匹配度=97%),结果如图2所示。

DNA序列分析显示,在构建质粒的多克隆位点内成功插入了ERE片段,说明pERE-TATA-Luc为准确质粒;受体表达质粒rERa/pCI的序列与扩增质粒序列匹对成功,说明rERa/pCI也为准确质粒。

图1 pERE-TATA-Luc的DNA序列鉴定Fig.1 DNA sequencing of pERE-TATA-Luc

图2 rERa/pCI的DNA序列鉴定Fig.2 DNA sequencing of rERa/pCI

2.2 体外细胞检测体系的验证

2.2.1有效性验证结果

在转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-Luc的情况下给予不同浓度的E2,检测报告基因的表达。结果显示,E2与荧光素酶的表达存在显著的剂量-反应关系。在未转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc的情况下，同样给予不同浓度的E2,检测报告基因的表达,结果显示,报告基因的表达无明显变化,与pERE-TATA-Luc存在时差异明显(图3)。

图3 E2对转染细胞报告基因表达结果的影响Fig.3 Effect of E2 on expression of reporter gene in transfected cells

2.2.2灵敏性结果

对共转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc和受体质粒rERa/pCI的CV-1细胞,给予不同浓度(10-12～10-8mol·L-1)的E2,检测报告基因的表达。结果显示,E2与荧光素酶的表达存在显著的剂量-反应关系,从10-11mol·L-1起表达开始增强,在10-9mol·L-1时达最大值,EC50值为6.1×10-11mol·L-1。SUN等[18]研究结果显示,E2的EC50值为4.7×10-9mol·L-1；赵海涛等[19]研究结果显示,MCF-7细胞E2的EC50值为5×10-11mol·L-1。可见,笔者研究的CV-1细胞受体报告基因试验具有较高的灵敏性。己烯雌酚是人工合成的非甾体类药用雌激素,有报道称己烯雌酚是除雌二醇以外最强的环境雌激素样化合物[20]。检测发现,己烯雌酚从10-11mol·L-1起表达开始增强,在10-7mol·L-1时达最大值,EC50值为2.4×10-11mol·L-1,在哺乳动物细胞中己烯雌酚的雌激素活性大于雌二醇,与COLDHAM等[20]研究结果一致。此外,检测发现木黄酮有微弱的雌激素活性,这与木黄酮的结构和雌二醇相似有关,可以补充人类雌激素的不足。由图4可见,这3种化合物雌激素活性大小为己烯雌酚(CAS号为6898-97-1)>雌二醇(CAS号为50-28-2)>木黄酮(CAS号为446-72-0)。

2.2.3重复性试验结果

CV-1细胞转染质粒pERE-TATA-Luc和rERa/pCI后,以10-9mol·L-1的E2进行染毒,在同一块24孔板设置3个复孔,测定E2对Luc的诱导作用,板内变异系数为8.7%;另外,10-9mol·L-1的E2在不同板间测定3次,板间变异系数为10.6%。

通过重复性试验,多代细胞(3代和20代)培养对比荧光素酶的诱导,结果(表1)显示,CV-1细胞报告基因试验具有较好的稳定性。因此,该研究建立的CV-1细胞受体报告基因试验可用于双酚A类似物的雌激素效应的研究。

图4 己烯雌酚、雌二醇和木黄酮的雌激素活性Fig.4 Estrogenic activities of diethylstilbestrol, estradiol and genistein

表1重复性试验结果

Table1Resultsofrepeatabilitytest

化合物ρ/(mol·L-1)第3代细胞第20代细胞雌二醇6.1×10-117.2×10-11己烯雌酚2.4×10-112.6×10-11

木黄酮雌激素活性弱，故未计算出半数有效浓度。

2.3 双酚A类似物对雌激素受体(ER)的作用

双酚A、双酚B、双酚AF、双酚F、双酚S、双酚AP、双酚Z和双酚P这8种双酚A类似物的分子结构和雌激素效应有效浓度EC50如表2所示。

根据8种化合物的剂量-效应曲线计算了8种双酚A类似物的EC50值。从图5可以看出,BPAF的荧光素酶诱导效应最高,EC50值为1.5×10-6mol·L-1,其次是BPF,EC50值为1.6×10-6mol·L-1,BPB的EC50值为5.5×10-6mol·L-1,BPAP、BPS和BPP荧光素酶诱导能力较弱,EC50值分别为1.1×10-7、5.4×10-6和3.3×10-6mol·L-1。如表2所示,响应值较高的 BPAF、BPF、BPB和BPA 的荧光素酶诱导能力分别为E2对照 的81.5%、73.7%、62.7%与 57.9%,BPZ、BPAP、BPS和BPP诱导荧光色酶均未达到E2对照的50%。因此,8种双酚A化合物雌激素活性大小顺序为BPAF> BPF> BPB> BPA> BPZ> BPAP> BPS> BPP。

其中,BPAF由于BPA中的丙烷基被疏水基团氟原子取代,碳桥上烷基被三氟取代,表现出了最强的雌激素活性,这可能与氟取代后甲基位置的亲水性大大增加有关[21]。MATSUSHIMA等[22]开展的体外细胞试验结果显示,BPAF与雌激素受体 α(ERα)的亲和力高于BPA,雌激素活性更强,笔者的研究结果与其基本一致。取代基数目减少和取代基的大小也会影响雌激素的活性,如BPF碳桥上没有甲基,BPA碳桥上有 2个甲基,导致BPF的雌激素活性大于BPA。BPAP碳桥上甲基被苯环取代,BPZ碳桥上甲基被环己烷取代,导致其雌激素活性均小于BPA。梁栋[23]通过雌激素受体调控的荧光色素酶基因表达比较BPA和BPF的雌激素活性,笔者的研究结果与其基本一致。

表28种双酚A类似物的结构和半数效应有效浓度

Table2Structuresandhalfeffectiveconcentrationof8bisphenolAanalogues

化合物结构式EC50值/(mol·L-1)双酚A(BPA)1.4×10-6双酚B(BPB)5.5×10-6双酚AF(BPAF)1.5×10-64,4'-二羟基二苯(BPF)1.6×10-6双酚AP(BPAP)1.1×10-7双酚S(BPS)5.4×10-6双酚Z(BPZ)4.9×10-6双酚P(BPP)3.3×10-6

3 讨论与结论

受体介导理论是雌激素受体(ER)报告基因试验的理论基础,尚无统一的标准方法,其差别包括细胞株、受体表达质粒、报告基因、转染方法和激动剂或拮抗剂的阳性对照等。研究认为各实验室可以根据具体情况,选择并建立合适的ER报告基因实验。酵母表达系统虽然能够有效筛选ER激动剂,但缺乏对拮抗剂的检出效力,因此基于哺乳动物细胞的ER报告基因试验在内分泌干扰物研究中得到广泛关注和快速发展。CV-1细胞具有易于培养、条件便于控制、培养成本较低等优点,背景值比MCF-7细胞低,可用于多种试验。

图5 8种双酚A类似物的雌激素活性Fig.5 Estrogenic activities of 8 bisphenol A analogues

笔者构建雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc和受体质粒rERa/pCI共转入CV-1细胞,从而使转染细胞可与具有雌激素效应的化学物质反应,引起Luc荧光素酶的表达。以雌二醇作为阳性对照物验证检测系统的有效性,结果显示,在转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc的情况下,E2与荧光素酶的表达存在显著的剂量-反应关系,而未转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc的情况下不能引起Luc报告基因的表达。从E2浓度为10-11mol·L-1起表达开始增强,在10-9mol·L-1时达最大值,EC50值为6.1×10-11mol·L-1,与其他研究学者建立的细胞系相比具有较好的灵敏性。重复性试验显示,CV-1细胞受体报告基因试验具有较好的稳定性。

基于非洲猴肾CV-1细胞受体报告基因试验,研究了双酚A类似物拟雌激素干扰活性,雌激素活性表现为BPAF> BPF> BPB> BPA> BPZ> BPAP> BPS> BPP。CV-1细胞受体报告基因试验是一种筛选雌激素活性内分泌干扰物的快速、有效的方法。

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EstablishmentofCV-1Cell-BasedEstrogenReceptorReporterGeneAssaysMethodandDeterminationofEstrogenEffectofBisphenolAAnalogues.

FAN De-ling, JI Gui-xiang, YANG Xian-hai, WANG Zhen, WANG Lei, LIU Ji-ning, SHI Li-li

(Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China)

With luciferase being used as reporter gene, reporter gene plasmid with luciferase (pERE-TATA-Luc) was regulated by estrogen response element and estrogen receptor expression plasmid (rERa/pCI) was obtained. Using the transient co-transfection method, luciferase reporter gene plasmid and estrogen receptor expression plasmid were transfected into the kidney cells (CV-1) of an African monkey. Estradiol was used as CK for positive phenomenon. E2induced expression of luciferase significantly when it was 10-10mol·L-1in concentration and to the maximum when it was 10-9mol·L-1in concentration, and its EC50was 6.1×10-11mol·L-1. Through validating sensitivity, efficacy and stability of the estradiol, diethylstilbestrol and genistein detecting systems, a stable sensitive estrogen receptor reporter gene cell line was established for laboratory. Based on the CV-1 receptor gene reporter assay, interferon activity of bisphenol A analogues type of estrogen was studied. In terms of estrogenic activity, a decreasing order of BPAF > BPF > BPB > BPA > BPZ > BPAP > BPS > BPP was found. All the findings demonstrate that the CV-1 cell receptor reporter gene assay is a rapid effective procedure for screening endocrine disrupting chemicals for estrogenic activity.

bisphenol A analogues； estrogenic activity；invitrotest

2016-11-03

中央级公益性科研院所基本科研业务专项(20160407); 江苏省自然科学基金(BK20151100)

① 通信作者E-mail： ljn@nies.org

X826

A

1673-4831(2017)10-0955-06

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.10.013

范德玲(1988—),女,安徽合肥人,助理研究员,硕士,从事环境内分泌干扰效应体外细胞研究。E-mail: fdl@nies.org

责任编辑： 许 素)