锦鲤疱疹病毒ORF126-ORF27融合蛋白的表达及免疫原性分析

文/梁思源 吕春爽 安红艳 李全振 赵宝华

锦鲤疱疹病毒ORF126-ORF27融合蛋白的表达及免疫原性分析

文/梁思源1吕春爽1安红艳1李全振2赵宝华1

根据锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）囊膜蛋白ORF27基因和糖蛋白ORF126基因序列设计特异性扩增引物，通过PCR成功克隆了锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）ORF27基因和ORF126基因片段，分别将ORF27基因、ORF126基因以及ORF126-ORF27融合基因与原核表达载体pMAL-c2x连接构建重组表达质粒pMAL-c2x-ORF126，pMAL-c2x-ORF27，pMAL-c2x-ORF126-ORF27，并转化受体菌BL21（DE3），筛选得到重组菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126），BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF27），BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126-ORF27）。IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析表明均产生大量目的蛋白；Western blotting分析显示目的蛋白均具有良好的的免疫原性；表达的蛋白与佐剂1:1震荡乳化后免疫小鼠，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中的抗体效价。结果表明重组菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126-ORF27）的血清抗体效价明显高于单蛋白，本试验研究结果为进一步开发研制锦鲤疱疹病毒病基因工程疫苗奠定了基础。

鲤鱼是我国淡水养殖主要品种之一，锦鲤疱疹病毒病可导致发病鲤鱼的大量死亡。锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus dasease，KHVD）的病原体为锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV），属于异疱疹病毒科鲤鱼病毒属，是一种线性、双链DNA病毒，基因组大小约为295kb。1998年从美国和以色列的患病鲤鱼中首次分离出锦鲤疱疹病毒，随后该病毒在世界各地陆续发现并报导2002年4月在广东省某锦鲤养殖场进口的锦鲤中首次发现锦鲤疱疹病毒感染，后经nested-PCR检测证实导致锦鲤死亡的病原体为KHV，该病具有高传染性和高致病性等特点，春夏秋季节为该病的高发期，病情一旦爆发，难以控制，严重时致死率可达90%以上，目前还不具备有效的药物对其进行治疗，因此，采用免疫接种的方法来预防该疾病的发生和传播具有重要的现实意义。

研究表明，成熟KHV病毒粒子由40种蛋白质组成，包括3个核衣壳蛋白、13个囊膜蛋白、2个间质蛋白，及22个未分类的结构蛋白。病毒的囊膜决定病毒分子的抗原性，在病毒侵染过程中发挥关键作用，袁海延等人的研究结果表明囊膜蛋白ORF27抗原性良好，可用于锦鲤疱疹病毒核酸疫苗的研究，王好等人的研究结果表明采用重组质粒表达锦鲤疱疹病毒ORF126糖蛋白取得较好的免疫效果。本试验根据锦鲤疱疹病毒ORF27和ORF126的基因序列设计特异性扩增引物获得ORF27和ORF126基因，分别构建原核表达质粒，研究囊膜蛋白ORF27、糖蛋白ORF126以及融合蛋白ORF126-ORF27的免疫原性，为探索锦鲤疱疹病毒病的免疫方法开辟一条新道路。

一、材料与方法

1.载体、菌株与实验动物

患病鲤鱼组织由河北省水产养殖病害防治监测总站提供；表达质粒pMAL-c2x由本实验室（河北师范大学生命科学学院微生物实验室）保存；E.coli DH5α感受态和E.coli BL21（DE3）感受态细胞、4周龄的昆明雌性小鼠。

2.主要试剂

Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶、5K DNA Marker、15K DNA Marker、基因组提取试剂盒、TMB单组份显色液、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、ClonExpress☒MultiS一步克隆试剂盒、鼠抗麦芽糖结合蛋白标签（MBP）、过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG。

3.引物的设计与合成

根据NCBI公布的KHV ORF126（ID：11266456），KHV ORF27（ID：11945559）基因序列，利用Primer Premiers 5.0软件设计含有酶切位点的特异性扩增引物（见表1），并在上下游引物5，端引入相应的限制性内切酶位点（划线部位），送到生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1.KHV ORF126、ORF27基因特异性引物

4.锦鲤疱疹病毒3型ORF126和ORF27基因片段的PCR扩增

根据表1各基因的特异性引物，以KHV基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增，采用25ul反应体系：ddH2O：18ul；10×buffer（含Mg2+）：2.5ul；dNTPs（2.5mM）：1ul；Primer F（10uM）：1ul；Primer R（10uM）：1ul；模板：1ul；Taq-T DNA聚合酶：0.5ul；

ORF126基因的反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃30s，58.5℃30s，72℃55s，30个循环后，72℃延伸10分钟，4℃保存；ORF27基因的反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃ 30s，60.5℃30s，72℃20s，30个循环后，72℃延伸10分钟，4℃保存；反应完成后，将5ul PCR产物与1ul 6×loading buffer混匀后，采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

5.pMAL-c2x-ORF126、pMAL-c2x-ORF27和pMAL-c2x-ORF126-ORF27重组质粒构建

将PCR成功获得的ORF126基因与原核表达载体pMAL-c2x用限制性内切酶EcoR I和Xba I进行双酶切，回收目的片段，通过T4 DNA连接酶进行连接，构建重组表达质粒pMAL-c2x-ORF126；同上，使用限制性内切酶Xba I和Hind III构建重组表达质粒pMAL-c2x-ORF27；同上，使用限制性内切酶EcoR I、Xba I和Hind III构建重组表达质粒pMAL-c2x-ORF126-ORF27。分别转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），筛选阳性转化子。

6.诱导重组菌株表达和Western blot 分析

将筛选得到的重组菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126）、BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF27）、BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126-ORF27）和转化含有空质粒pMAL-c2x的大肠杆菌BL21（DE3）（pMAL-c2x）分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃180rpm过夜培养活化后，按照V（菌种）：V（LB）=1:100的比例接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃ 180rpm扩培2h～3h，直至OD600达到0.4h～0.6h，加入IPTG溶液至终浓度为0.5mmol/L，16℃ 180rpm诱导表达20h。诱导的菌体超声破碎后离心获取可溶性蛋白，SDS-PAGE电泳后，通过转膜将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，孵育鼠抗麦芽糖结合蛋白标签（MBP）为一抗，孵育过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG为二抗，通过显色液显色后进行分析。

7.重组菌株的小鼠免疫试验

选取4周龄，体重约25g的昆明雌性小鼠，随机分为5组，分别为：生理盐水组、空载对照组、ORF27实验组、ORF126实验组和ORF126-ORF27实验组，每组10只，腹腔注射。组1注射100☒L0.9%生理盐水，组2注射100☒L蛋白含量是100☒g的空载蛋白，组3注射100☒L蛋白含量是100☒g的ORF27蛋白疫苗，组4注射100☒L蛋白含量是100☒g的ORF126蛋白疫苗，组5注射100☒L蛋白含量是100☒g的ORF126-ORF27蛋白疫苗。共免疫3次，一免使用等体积的弗氏完全佐剂，二免和三免使用等体积的弗氏不完全佐剂，每次间隔7天，断尾取血，12000rpm4℃离心15分钟，收集血清，通过间接ELISA实验检测其抗体效价。

二、结果

1.锦鲤疱疹病毒3型ORF126和ORF27基因的PCR扩增

以KHV基因组DNA为模板，经PCR扩增及1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，获得的KHV ORF27和ORF126基因片段与目的基因大小相符（见图1和图2）。

3.重组菌株的诱导表达及Western blot 分析

将筛选得到的重组菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126）诱导表达后，经SDS-PAGE分析，ORF126基因表达蛋白的理论分子质量是29.9kDa，pMAL-c2x载体带有的麦芽糖结合蛋白标签大约42.5kDa，因此重组表达质粒pMAL-c2x-ORF126表达蛋白的理论分子量约为72.4kDa，BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126）诱导后在72.4kDa处可见明显的蛋白条带，与预期ORF126蛋白大小一致（见图9）；经Western blot 分析表明，ORF126蛋白特异性良好。

2.重组质粒pMAL-c2x-ORF27、pMAL-c2x-ORF126和pMAL-c2x-ORF126-ORF27鉴定

重组表达质粒pMAL-c2x-ORF27经PCR验证、双酶切鉴定和测序分析，结果显示ORF27基因的原核表达载体构建成功（见图3和图4）。

重组菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF27）诱导表达后，经SDS-PAGE分析，在49.8kDa处可见明显的条带，与预期ORF27蛋白大小一致（见图10），经Western blot 分析表明，ORF27蛋白特异性良好。

重组表达质粒pMAL-c2x-ORF126经PCR验证、双酶切鉴定和测序分析，结果显示ORF126基因的原核表达载体构建成功（见图5和图6）。

重组菌株BL21（DE3）（pMAL-c2x-ORF126-ORF27）诱导表达后，经SDS-PAGE分析，在79.7kDa处可见明显的蛋白条带，与预期ORF126-ORF27蛋白大小一致（见图11）；上清液经Western blot 分析表明，ORF126-ORF27蛋白特异性良好。

重组表达质粒pMAL-c2x-ORF126-ORF27经PCR验证、双酶切鉴定和测序分析，结果显示ORF126-ORF27基因的原核表达载体构建成功（见图7和图8）。

4.融合蛋白ORF126-ORF27免疫原性分析

重组蛋白ORF126、ORF27和ORF126-ORF27免疫后的小鼠血清进行ELISA检测发现，ORF27免疫组血清稀释度在80000以上，P/N值均大于2.1，抗体效价为1∶80000；ORF126免疫组血清稀释度在320000以上，P/N值均大于2.1，抗体效价为1∶320000；ORF126-ORF27免疫组血清稀释度在1280000以上，P/N值均大于2.1，抗体效价为1∶1280000；具体检测结果见表2、表3、表4。检测数据显示，ORF27、ORF126和ORF126-ORF27的免疫原性均较好，融合蛋白ORF126-ORF27免疫组小鼠血清中的抗体效价明显高于ORF27和ORF126免疫组，且相同稀释倍数下，融合蛋白ORF126-ORF27的抗体效价高于ORF27和ORF126蛋白免疫组，说明融合蛋白ORF126-ORF27的免疫原性优于单蛋白ORF27和ORF126。

表2.重组蛋白ORF27免疫ELISA结果

表3.重组蛋白ORF126免疫ELISA结果

表4.重组蛋白ORF126-ORF27免疫ELISA结果

三、讨论

KHV是一种主要危害鲤鱼的急性传染病病原，KHV的传染性极强，健康鲤鱼一旦接触到已感染的鲤鱼或者水，就会被感染，若发病可给鲤鱼养殖带来较大的经济损失。目前PCR是检测KHV感染最为精确的检测方法，其中以主要囊膜蛋白基因为模板检测KHV灵敏度更高，有效的药物和疫苗可以抑制该病的感染，对KHVD进行防治的有效方法是免疫，研究表明组织灭活疫苗对该病的免疫效果并不理想，采用减毒疫苗免疫保护率虽然较高，但是减毒疫苗存在病毒变异的可能性较大，相比之下，开发有效的基因工程疫苗控制KHV在全球范围的暴发显得尤为重要。目前对KHV相关基因工程疫苗的制备较少，在已知的众多KHV功能基因中，只有少部分获得研究。

已有研究表明ORF27和ORF126免疫原性较高，本实验以囊膜蛋白ORF27和糖蛋白ORF126为对象，成功克隆得到大小为207bp和822bp的全基因序列，分别构建ORF27、ORF126和ORF126-ORF27基因的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达后经Western blotting分析显示目的蛋白均具有良好的的免疫原性，获得的蛋白作为疫苗免疫昆明小鼠，研究融合蛋白ORF126-ORF27的免疫原性，ELISA检测结果发现ORF27、ORF126和ORF126-ORF27蛋白均可以检测到KHV抗体，免疫原性均较好，其中融合蛋白ORF126-ORF27的免疫原性与单蛋白ORF27和ORF126相比具有很大的优势，因此采用融合基因研制安全高效的防治KHVD感染的基因工程疫苗前景广阔，本研究结果对该病的防治及基因工程疫苗的研制具有重要意义。

作者单位：1.河北师范大学生命科学学院 2.河北省水产养殖病害防治监测总站