反相高效液相色谱法同时测定青蟹组织中磺胺嘧啶和甲氧苄啶残留

陈进军， 王 元， 赵留杰， 沈锦玉， 房文红*

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.浙江省淡水水产研究所，浙江湖州 313001)

磺胺类药物(Sulfonamides)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，对大多数革兰氏阴性和阳性细菌有抑制作用，广泛应用于水产养殖细菌性疾病的预防和治疗。由磺胺嘧啶和甲氧苄氨嘧啶组成的复方磺胺嘧啶粉是我国国标渔药，允许在鱼、虾、蟹等养殖动物中应用，甲氧苄氨嘧啶与磺胺嘧啶合用，具有增效作用[1]。有关生物样品中磺胺嘧啶和甲氧苄啶测定方法己有报道，主要集中在鸡[2 - 3]、鸵鸟[4]、猪[5]、马[6]等畜禽，水产品中鱼类[7]也有报道。Baert等[2]采用波长270 nm、240 nm分别检测磺胺嘧啶、甲氧苄啶，但对于单波长检测器而言操作繁琐；也有采用220 nm[4]、272 nm[7]和287 nm[6]紫外单波长同时检测的报道，但方法应用于本试验中，在低浓度时效果均不佳。

目前我国尚无同时检测水产品中磺胺药物和甲氧苄啶的方法，本研究优化了检测波长和生物样品提取方法，建立了同时检测青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃等组织中磺胺嘧啶和甲氧苄啶的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，为水产品中磺胺药物和甲氧苄啶药残检测奠定技术基础。

1 实验部分

1.1 仪器与设置

Waters 2695高效液相色谱仪，Aglient Zorbax SB-C18色谱柱(150×4.6 mm,5 μm)，Waters 2487紫外检测器；Millipore Milli-Q Advantage超纯水仪；Bertin precellys 240均质器；Eppendorf微量移液器；Hitachi CF16RⅡ高速冷冻离心机；亚荣RE-52A旋转蒸发仪；Rephile 0.22 μm微孔滤膜。

1.2 试剂和材料

磺胺嘧啶和甲氧苄啶标准品(纯度≥99.5%)购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，磺胺嘧啶和甲氧苄啶原粉(纯度≥98.0%)购于潍坊三江医药集团。甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷均为色谱纯，德国Merck公司产品；乙酸为优级纯，乙酸铵为分析纯，均购自国药集团上海化学试剂公司。

拟穴青蟹购于上海崇明县某养殖场，无磺胺嘧啶和甲氧苄啶使用记录。暂养于盐度10、水温为27 ℃±1 ℃的海水中，保持24 h充气，期间投喂新鲜螺蛳肉，一周后挑选健康、体重140±20 g的青蟹用于实验。

1.3 色谱条件

流动相为乙腈∶0.01 mol·L-1乙酸铵(pH=3.80)=12∶88(V/V)；柱温为35 ℃；进样量为10 μL;流速为1.0 mL·min-1；紫外检测波长：245 nm。

1.4 样品前处理

1.4.1血淋巴样品取出样品置室温融解后，10 000 r·min-1离心5 min，取0.4 mL上清液于2 mL离心管中，加入3倍体积乙腈，涡旋振荡2 min后，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液转移至5 mL离心管中,氮吹干后加入0.4 mL流动相定容，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用于RP-HPLC分析。

1.4.2肌肉、肝胰腺和鳃样品样品室温解冻后，取适量样品于均质器中均质。准确称取均质后样品1.00 g于10 mL离心管中，加入5 mL乙腈，振荡5 min，于10 000 r·min-1离心5 min，收集上清液；残渣再重复提取两次，合并三次上清液于100 mL具塞茄形蒸发瓶中，于温度40 ℃旋蒸至干。加入1 mL流动相和1 mL正己烷，盖上塞子置超声波清洗仪超声15 min，瓶底残留物完全溶解，将混合液体转移至2 mL离心管中，12 000 r·min-1离心5 min，吸取下层液体，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用于RP-HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1检测波长的比较对磺胺嘧啶和甲氧苄啶母液进行紫外吸收光谱扫描，为了兼顾两种药物同时检测，结合文献，选定220 nm[4]、245 nm、270 nm[3]三组检测波长进行对比试验，每组3个平行。结果表明:波长220 nm下，两种药物在低浓度时，基线噪音及杂质峰的响应值偏高，与药峰分离度不佳；270 nm虽是磺胺嘧啶的最大吸收波长，但不适用于甲氧苄啶，峰高和峰面积都偏低；245 nm下峰形和灵敏度良好，满足两种药物同时检测的需求。

2.1.2提取液的选择采用加标法比较了不同提取液提取肌肉中磺胺嘧啶和甲氧苄啶的回收率,见表1。4种提取液分别为乙腈[2,11]、甲醇[8]、乙酸乙酯[9]和二氯甲烷[10]。从回收率来看，不同提取液对肌肉提取效果不同，乙腈提取效果最好，其次为甲醇，再次为乙酸乙酯，二氯甲烷最差。二氯甲烷加入后，肌肉成团且有油脂性物质浮于试液之上，不利于操作；乙腈萃取样品贴壁及沉淀蛋白效果良好，回收率高，最终选择乙腈作提取剂。

表1 不同提取液下肌肉中添加磺胺嘧啶、甲氧苄啶的回收率(n=3)

2.2 色谱行为图

图1 青蟹组织样品中磺胺嘧啶和甲氧苄啶的色谱图Fig.1 Chromatograms of sulfadiazine and trimethoprim in Scylla Paramamosain tissues hemolymph at 4 h after dosing

青蟹组织样品血淋巴的色谱行为见图1(其余图略)。本实验中，血淋巴和肌肉最终选用的是乙腈∶0.01 mol·L-1乙酸铵(pH=3.80)=12∶88(V/V)作为流动相，结果显示虽然药峰稍有拖尾，但峰形尖锐对称，基线平稳且无杂峰干扰。因肝胰腺和鳃样品中内源性干扰，为更好将药峰与杂峰分开，将流动相比例调至乙腈∶0.01 mol·L-1乙酸铵=13∶87(V/V)。

2.3 标准曲线及检测限

应用优化的检测波长和流动相，建立磺胺嘧啶和甲氧苄啶的标准曲线。磺胺嘧啶在0.05～10 μg·mL-1范围内建立的标准曲线线性关系良好，其标准曲线方程为：y=7133.53x+129.61(R2=0.9999)；甲氧苄啶在0.05～10 μg·mL-1范围内建立的标准曲线线性关系良好，标准曲线方程为：y=5089.39x+61.12(R2=0.9999)。磺胺嘧啶在青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃加标后定量限分别为0.05 μg·mL-1、0.05 μg·g-1、0.05 μg·g-1和0.05 μg·g-1；甲氧苄啶在青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃加标后定量限分别为0.05 μg·mL-1、0.05 μg·g-1、0.05 μg·g-1和0.05 μg·g-1。

2.4 回收率及精密度

采用加标法测定青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃中磺胺嘧啶和甲氧苄啶回收率，每个浓度3个平行，按“样品前处理”方法处理，采用RP-HPLC法测得其药物浓度。同时，采用加标法测定方法学的日内精密度和日间精密度(精密度由变异系数表示)。

加标法测得各组织回收率结果如表2所示，可以看出，各组织的药品回收率都较高，均在80%以上；通过精密度试验，得出青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鳃中磺胺嘧啶的日内精密度分别为：1.77%、2.19%、2.53%和2.08%，日间精密度分别为：2.84%、2.27%、3.30%和2.96%；甲氧苄啶的日内精密度分别为：4.09%、2.10%、1.75%和2.49%，日间精密度分别为：4.82%、1.95%、2.37%和3.10%。

表2 磺胺嘧啶和甲氧苄啶在青蟹组织样品中的回收率(n=3)

3 结论

本文在比较检测波长和提取方法的基础上，建立了同时检测青蟹组织样品中磺胺嘧啶和甲氧苄啶残留的反相高效液相色谱法。在245 nm紫外波长下检测药物，以乙腈为提取剂，方法操作简单，无杂峰干扰，重现性和稳定性高，满足药物残留检测要求。