5 687例高通量基因测序产前筛查指征及结果分析

林晓娟，李 静，宋筱玉，唐中锋，葛婷婷，孙庆梅

(甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050)

5 687例高通量基因测序产前筛查指征及结果分析

林晓娟，李 静，宋筱玉，唐中锋，葛婷婷，孙庆梅

(甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050)

目的探讨孕期开展高通量基因测序产前筛查技术的临床应用价值。方法回顾性分析在甘肃省妇幼保健院就诊的自愿接受高通量基因测序产前筛查单胎妊娠孕妇5 687例，采用高通量测序平台对孕妇外周血游离胎儿DNA进行测序分析，对测序结果进行生物信息分析，提示高风险及性染色体异常者，进一步行羊膜腔穿刺进行胎儿染色体核型分析。结果5 687例孕妇中游离胎儿DNA高通量基因测序技术检出37例21-三体高风险，5例18-三体高风险，2例13-三体高风险，性染色体异常30例。羊水染色体核型分析证实其中30例胎儿21-三体，3例18-三体，性染色体异常12例，高通量基因测序技术对于21-三体阳性预测值可达97%。结论高龄孕妇是胎儿染色体异常的高危人群。高通量基因测序技术是胎儿21-三体的有效产前筛查方法，它具有无创、准确的特点，且筛查结果不受孕周限制，具有较高的临床应用价值。

高通量基因测序技术；产前筛查；21-三体；产前诊断

出生缺陷已成为影响人口素质和群体健康水平的公共卫生问题，染色体异常是导致出生缺陷的重要因素，其中21-三体是最常见的常染色体疾病，发生率为1/800。三级预防措施中二级预防措施(产前筛查及产前诊断)是预防出生缺陷最有效的环节。近年来，高通量基因测序产前筛查技术的探索和实施，为临床开辟了一条新的产前筛查模式。本研究总结甘肃省妇幼保健院已完成的5 687例高通量基因测序产前筛查结果，旨在探讨高通量基因测序产前筛查的临床应用价值。

1资料与方法

1.1研究对象

选择2014年1月到2016年5月在甘肃省妇幼保健院接受产前检查的单胎妊娠孕妇5 687例，自愿参加孕期高通量基因测序产前筛查方案。高通量基因测序产前筛查指征如下：母体血清学产前筛查结果临界风险孕妇、母体血清学产筛结果高风险孕妇、高龄孕妇、未行孕早中期母体血清学产前筛查、孕早期有服药史、有不良孕史孕妇，自主要求高通量基因测序产前筛查等。孕妇年龄为20～43岁，孕周为12～32周，孕妇知情并自愿参加筛查。筛查前孕妇均签署知情同意书并了解高通量基因测序产前筛查的局限性。

1.2方法

高通量基因测序产前筛查检测是通过采集孕妇的外周血，提取游离DNA，采用第二代高通量测序结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整倍体疾病的风险率。具体操作流程：①抽取孕妇5～10mL外周血；②血浆分离；③DNA提取；④文库构建；⑤上机测序；⑥数据分析；⑦生产报告。筛查结果为高风险的孕妇做羊水穿刺进行产前诊断。

2结果

2.1高通量基因测序产前筛查异常检出情况

5 687例孕妇接受高通量基因测序产前筛查，其中72人高通量基因测序产前筛查提示高风险，经产前诊断确诊胎儿染色体异常共45例。其中高龄孕妇胎儿染色体核型异常比例占42.2%(19/45)，母体血清学产前筛查临界风险者胎儿染色体核型异常比例占22.2%(10/45)，母体血清学产前筛查高风险者胎儿染色体核型异常比例占17.8%(8/45)，超声检查异常者胎儿染色体核型异常比例占11.1%(5/45)。

2.2高通量基因测序产前筛查及产前诊断的结果比较

本研究共5 687人参加高通量基因测序孕期产前筛查，21-三体高风险37例，3例自行引产，1例胎死宫内，1例失访，1例拒绝产前诊断生后确诊为21-三体综合征，接受羊水穿刺产前诊断确诊30例，共计31例21-三体，1例胎儿染色体核型分析提示无异常。31例胎儿染色体核型结果与高通量基因测序产前筛查结果一致，21-三体阳性预测值达97%。18-三体高风险5例，3例接受羊水穿刺确诊为18-三体综合征，1例拒绝羊水穿刺胎儿生后3个月不明原因夭折，1例高通量基因测序检测后胎死宫内。性染色体异常30例，13-三体高风险2例，均接受产前诊断确诊，2例X0，4例XXX，5例XXY，1例XYY。随访结果假阴性0例。高通量基因测序产前筛查检测性染色体非整倍体异常的阳性预测值较低，为40.0%(12/30)，见表1。

表1 高通量基因测序产前筛查高风险结果及产前诊断的结果(n)

3讨论

3.1高通量基因测序孕期产前筛查的临床意义

如何降低出生缺陷发生率，仍是目前我国所面临的重大公共卫生问题之一。2001年我国开始实施出生缺陷干预工程，但我国的出生缺陷率仍高达5.6%，每年新增出生缺陷人数约90万。二级预防是三级预防中最为主要的环节，出生缺陷产前筛查和产前诊断是减少出生缺陷最有效的预防手段之一。目前我国大部分机构仍用传统的孕中期母体血清甲胎蛋白和β绒毛膜促性腺激素的“二联”产前筛查和“三联”产前筛查(甲胎蛋白、β绒毛膜促性腺激素和妊娠相关蛋白A)为主。目前我院采用的筛查模式为孕早期“一站式”产前筛查，即母体血清学筛查(β绒毛膜促性腺激素和妊娠相关蛋白A)联合胎儿颈项透明层的厚度进行早孕期产前筛查和孕中期母体血清学产前筛查以“三联”产前筛查为主。我国原卫生部于2010年颁布实施了《胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准》(WS322.1-2010)，该标准提出中孕期血清学筛查的目标为：“二联”筛查检出率>60%，“三联”筛查检出率>70%，“四联”筛查检出率>80%，并对产前筛查的多个环节进行了规范和质控[1]。但传统的血清学产前筛查方法根本无法避免假阴性率引起的医疗纠纷，对于筛查高危人群需再进一步进行羊水或脐血产前诊断。随着新一代测序技术的发展，高通量基因测序逐渐成为产前筛查的新模式，其较血清学筛查具有更高的特异性和敏感性。其理论依据是孕妇母体外周血浆中存在胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)和胎儿游离RNA(cell-free fetal RNA，cffRNA)，胎儿染色体异常会引起游离DNA含量的微量变化[2]。我院2015年获得国家首批临床应用高通量基因测序产前筛查技术试点单位资质，至2016年共完成5 687例，其中37例21-三体高风险，5例18-三体高风险，性染色体异常30例，接受羊水穿刺胎儿染色体核型分析，确诊30例为21-三体综合征，1例21-三体高风险行羊水穿刺后胎儿染色体核型无异常，18-三体综合征3例，2例X0，4例XXX，5例XXY，1例XYY，随访结果假阴性0例。31例胎儿染色体核型结果与高通量基因测序产前筛查结果一致，对21-三体阳性预测值达97%。本研究中高通量基因测序产前筛查18-三体及13-三体高风险者较少，有待于今后的工作中进一步探讨。高通量基因测序技术对于性染色体非整倍体异常的阳性预测值较低，为40.0%，可能与本技术存在一定的缺陷有关[3]。因此对于性染色体非整倍体异常的确诊需通过羊水或脐血胎儿染色体核型分析才能确诊。与孕中期血清学筛查相比，高通量基因测序检出率明显提高。高通量基因测序产前筛查是一项精确度接近于产前诊断的筛查新技术。大量文献证实，高通量基因测序孕期产前筛查可提高产前筛查效率，降低产前筛查假阳性率，在诊断胎儿非整倍体畸形方面显示出巨大的优势和发展潜力[4-5]。高通量基因测序产前筛查对21-三体的高敏感度、特异度、阳性预测值及正确率，与染色体核型分析技术有较高的一致性，且高通量基因测序孕期产前筛查不仅有效缓解了孕妇及家属的心理压力，而且接受度较羊水穿刺明显提高。它避免了产前诊断引起的胎儿流产、孕妇焦虑等并发症。由此可见，高通量基因测序孕期产前筛查技术是胎儿21-三体的有效筛查方法。

3.2高通量基因测序孕期产前筛查应用的前景

有文献证实，高通量基因测序孕期产前筛查方法具有操作直接、简便无创、准确性高、孕周范围广的特点，且筛查结果不受孕周不明确、妊娠合并症等因素影响，缺憾是费用过高[6]。近年来，随着我国精准医学的发展，我国在精准医学具体实施、基因检测行业规范、质检质评、标准指南等方面均取得了重要进展。2017年部分发达城市将高通量基因测序孕期产前筛查价格大幅降低或纳入医疗保险。2014年英国皇家妇产科医师学会发表了第15号科学影响性文件，对无创产前基因检测(NIPT)这一临床技术进行了评估，并将NIPT纳入英国国家医疗服务体系，提供了备选方案和建议[7]。但我省地处西部地区，经济、文化水平欠发达，仍有一部分孕妇认为产前筛查具有不确定性，或错过产前筛查时机，或因当地未开展而不知晓产前筛查等而未行产前筛查；也有少部分人单一地考虑产前诊断的创伤性，存在侥幸心理拒绝进一步的产前诊断而导致21-三体综合征患儿的出生[8]。本研究中有11例孕妇因母体血清学筛查检测结果为临界风险进而选择高通量基因测序最终确诊胎儿为染色体数目异常。高通量基因测序可作为母体血清学筛查临界风险孕妇的有效补充检测手段。本研究显示，孕妇高龄、母体血清学产前筛查高风险及临界风险、超声异常是高通量基因测序预测胎21-三体综合征的有效指标，其中高龄孕妇仍是胎儿染色体异常的高危人群。因此，加强高危孕妇及高龄孕妇的管理，积极地进行健康教育，提高产前筛查及产前诊断的依从性，可有效减少不良妊娠结局的发生。

[1]蒋宇林,边旭明.唐氏综合征产前筛查模式的发展[J].中华检验医学杂志，2011,34(11):1053-1056.

[2]李春艳,燕凤,张建芳,等.BACs-on-Beads技术对NIPT阳性结果的诊断价值[J].中国妇幼健康研究,2016,27(12):1481-1482.

[3]Bianchi D W,Rava R P,Sehnert A J,etal.DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening[J].N Engl J Med,2014,371(6):578.

[4]滕月,刘丹,黄谱,等.NIPT应用于胎儿非整倍体畸形诊断的研究进展[J].中国妇幼健康研究,2016,27(2):259-261.

[5]Norton M E,Jacobsson B,Swamy G K,etal.Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy[J].N Engl J Med,2015,372(17):1589-1597.

[6]周琴,郑芳秀,陈英苹,等.高通量基因测序对血清学筛查临界风险孕妇的应用价值[J].重庆医学,2016,45(27):3780-3782.

[7]Royal College of Obstetricians and Gynaecologists.Scientific Impact Paper No.15:Non-invasive prenatal testing for chromosomal abnormality using maternal plasma DNA[J].Obstet Gynecol,2014,16(2):148.

[8]于晓惠,张建平,邵茹彬,等.孕中期孕妇2389例产前筛查结果及影响因素分析[J].临床误诊误治,2012,25(10):58-60.

[专业责任编辑： 于学文]

Indicationsandresultanalysisof5 687casestakinghighthroughputgenesequencingprenatalscreening

LIN Xiao-juan, LI Jing, SONG Xiao-yu, TANG Zhong-feng, GE Ting-ting, SUN Qing-mei

(GansuMaternalandChildHealthCareHospital,GansuLanzhou730050,China)

ObjectiveTo explore the clinical value of application of high throughput gene sequencing prenatal screening technique during pregnancy.MethodsAltogether 5 687 pregnant women with singleton pregnancy visiting Gansu Maternal and Child Health Care Hospital and voluntarily receiving high throughput gene sequencing for prenatal screening were retrospectively analyzed. Free fetal DNA in maternal peripheral blood was sequenced using high throughput sequencing platform. Bioinformatics analysis was performed on sequencing results. Fetal chromosomal karyotype analysis was perfromed through amniocentesis in cases which were indicated to have high risks and sex chromosomal abnormalities.ResultsIn free fetal DNA from 5 687 pregnant women, high throughput gene sequencing technology detected that 37 cases had high risk of 21-trisomy, 5 cases had high risk of 18-trisomy, 2 cases had high risk of 13-trisomy, and 30 cases had sex chromosome abnormality. Among them 30 cases of 21-trisomy, 3 cases of 18-trisomy, and 12 cases of sex chromosome abnormalities were confirmed by amniotic fluid chromosome karyotype analysis. Positive predictive value of high throughput gene sequencing technology for 21-trisomy was as high as 97%.ConclusionElderly pregnant women are at high risk of fetal chromosomal abnormalities. High throughput gene sequencing is an effective prenatal screening method for fetal 21-trisomy. It has the features of noninvasion and high accuracy, and its screening results are not restricted by gestational age. Therefore, it has high clinical application value.

high throughput gene sequencing technology; prenatal screening; 21-trisomy; prenatal diagnosis

R714.5

A

1673-5293(2017)10-1279-03

2017-02-10

甘肃省出生缺陷防控重点实验室培育基地资助(1506RTSA158)，甘肃省自然科学基金资助项目(1606RJZA171)

林晓娟(1975—)，女，副主任医师，硕士研究生，主要从事产前优生咨询及胎儿医学的研究。

孙庆梅，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.10.039