九味肝泰对刀豆蛋白A诱导的C57BL/6J小鼠急性免疫性肝损伤的干预研究*

邓卫平 郑红梅 李胜保 郜元军 金 曙 陈德森

1.十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)消化内科 (湖北 十堰， 442000) 2.太和医院技能培训中心 3.湖北医药学院机能实验室

九味肝泰对刀豆蛋白A诱导的C57BL/6J小鼠急性免疫性肝损伤的干预研究*

邓卫平1郑红梅2李胜保1郜元军1金 曙1陈德森3△

1.十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)消化内科 (湖北 十堰， 442000) 2.太和医院技能培训中心 3.湖北医药学院机能实验室

目的：建立C57BL/6Jd小鼠急性免疫性肝损伤模型，观察九味肝泰对其免疫损伤及肝功能的影响。方法按随机原则将30只接种乙型肝炎病毒(HBV )的C57BL/6J品系转基因雄性小鼠分为对照组、模型组和九味肝泰组。采用尾静脉注射12mg/kg刀豆蛋白A(ConA)的方法诱导C57BL/6J小鼠急性免疫性肝损伤模型；成模8 h后九味肝泰组小鼠按(0.5mL/10g·d)灌10%九味肝泰混悬液干预性治疗7d，对照组及模型组小鼠灌胃等量生理盐水。检测干预前和干预7 d后小鼠肝功能[总胆红素(TBil)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转移酶(GGT)、总胆汁酸(TBA)、谷丙转氨酶(ALT)]、还原型谷胱甘肽(GSH)、血清中超氧化物歧化酶( SOD)和肝组织中丙二醛( MDA)。结果九味肝泰组小鼠在干预治疗7d后，TBil、AST、GGT、TBA、ALT与对照组比较，差异无显著性意义；GSH 和SOD升高、MDA明显降低，与同组干预前及模型组比较，P<0.05，差异有统计学意义。结论九味肝泰可抑制ConA诱导急性免疫性肝损伤小鼠的脂质过氧化反应，促进其肝功能恢复。

九味肝泰；C57BL/6J小鼠；刀豆蛋白A；急性免疫性肝损伤模型；肝功能

AbstractObjective:To establish the acute immune C57BL/6J mice liver injury model and observe the effect of nine kinds of Gantai on immune injury and liver function.Methods:Thirty male BABL/cJ mice were randomly divided into control group, model group and nine kinds of Gantai group;acute immune C57BL/6J mice liver injury model was set by intravenous injection of 12mg/ concanavalin A;nine kinds of Gantai group (0.5mL/10g in mice d) with 10% nine kinds of Gantai turbid suspension intervention for 7 days (d), blank control group and model group were given normal saline.Detected the mice liver function[total bilirubin (TBil), aspartate aminotransferase (AST), glutamyl transferase (GGT), total bile acid (TBA), alanine aminotransferase (ALT), glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD) content and in liver tissue (MDA)]before and after intervention.Results：Compared with the same group before treatment and model group ,Nine kinds of Gantai group in the intervention treatment of 7 days, TBil, AST, GGT, TBA and ALT near the level of the control group, GSH and SOD increased, MDA decreased significantly (P<0.05).Conclusion：nine kinds of Gantai inhibited concanavalin A induced lipid peroxidation in acute immunological liver injury and promote the recovery of liver function in acute immunological liver injury.

KeyWordsnine kinds of Gantai; C57BL/6J mice; acute immune liver injury model; liver function

肝损伤的原因复杂，如HBV感染、药物毒性或副作用等[1]。其中HBV引起的急、慢性病毒性肝炎多会造成严重的肝损伤，最终发展为肝硬化或肝癌[2，3]。研究表明，用ConA静脉注射接种HBV的C57BL/6J品系转基因小鼠可诱导出与人类极相似的急性肝损伤，这种动物模型被公认为最适合研究人类自身免疫性肝病及感染HBV的病毒性肝炎的病理机制[4]。九味肝泰具有化瘀通络、清热利湿、健脾疏肝之功效[5]。本实验以接种HBV的C57BL/6J品系转基因雄性小鼠为实验对象，试图探讨九味肝泰防治肝损伤的作用机制，以期为临床用药提供实验依据。

1. 材料与方法

1.1 动物及分组 SPF级雌性C57BL/6J小鼠30只，7周龄，体质量(20.76±3.05)g，动物由十堰市太和医院肝病研究所提供，许可证：[SCXK(京)2005-0013]。实验前先用随机数字表编号，然后随机分为对照组、模型组和九味肝泰组(每组10只)。动物房恒温，22 ℃，湿度50%～75 %，单笼无菌饲料饲养，12 h交替光照，自由饮水，保证动物福利[6]。

1.2 药物与试剂 九味肝泰(湖南新汇制药股份有限公司，规格：0.35g/粒，批号：B1400073185)。HBV病毒质粒( pUC18-HBV1.3)，本质粒具有繁殖能力，为十堰市太和医院肝病研究所在pUC18-HBV的BamHI和 Hind Ill位点插入1.3拷贝加长的HBV DNA重组质粒。ConA试剂(美国 Sigma公司，规格：100mg/支，批号：80M7680V)。

1.3 动物造模 造模前所有动物均禁食12h，不禁水， 模型组和九味肝泰组小鼠造模时采用高压水注射方法将pUC18-HBV1.3质粒(50μL)从小鼠尾静脉注入造成HBV病毒感染模型[7]。然后从尾静脉注射ConA试剂(12mg/kg)，8h后成模。对照组小鼠则从尾静脉注射(50μL)生理盐水。成模判断依据：预实验时我们用了6只SPF级雌性C57BL/6J小鼠按以上方法造模，在尾静脉注射ConA试8 h后，取小鼠尾静脉血50μL用RT-PCR法对HBV DNA定量分析，HBV DNA实时定量≥2.0×103copies/mL，均为阳性，且肝功能五项指标均显著升高，符合感染HBV后急性免疫性肝损伤指标[8]。模型组和九味肝泰组小鼠造模后HBV DNA均为阳性(100%)。

1.4 给药方法 尾静脉注射ConA 8h后，用小鼠灌胃针抽取预先配制好的10%九味肝泰混悬液(0.5mL/10 g·d)灌胃，2次/d，共7 d，对照组及模型组小鼠灌等量生理盐水(0.5mL/10 g·d)。

1.5 观察指标及方法 ①血清HBV DNA实时定量检测：采用实时定量RT-PCR法，在动物造模8 h和治疗7 d后，分别处死5只，摘取眼球取血进行HBV DNA定量分析，检测时取50μL静脉血加入10μL DNase液混匀，370C消化l6 h，然后用乙戊醇抽提HBV DNA。引物设计：CP2：5'-CTACAAACCTATGCGTGAG- 3fcw3a：5-TCAGCTTCCACCTAACCGTCA-3。②肝功能、血清SOD、GSH及肝组织MDA检测：取静脉血100μL，3000 r/min离心15 min， 离心半径87mm，分离出血清。按试剂盒说明测定小鼠血清TBil、AST、GGT、TBA、ALT水平。 小鼠取血后剪开腹部，取50mg肝组织，捣碎研磨，加入200μL 缓冲液匀浆，5000 r/min离心15min，取肝组织匀浆液的上清液检测MDA含量[8]。

2. 结果

2.1 3组小鼠两时段血清HBV DNA检测结果 见表1。

表1 3组小鼠两时HBV DNA.检测结果比较

与对照组比较，*P<0.05；与模型组同时段比较，△P<0.05；与本组成模8h比较，#P<0.05

2.2 3组小鼠两时段肝功能检测结果 见表2。

表2 3组小鼠肝功能指标比较

与对照组同时段比较，*P<0.05；与模型组治疗7d时比较，△P<0.05；与本组成模 8 h比较，#P<0.05

2.3 九味肝泰对小鼠血清SOD、GSH和肝组织MDA的影响 见表3。

表3 3组小鼠血清SOD、GSH和肝组织MDA结果比较

与对照组同时段比较，*P<0.05；与模型组治疗7d时比较，△P<0.05；与本组成模 8 h比较，#P<0.05

3 讨论

ConA是T细胞丝裂原,是从刀豆中提取的一种植物凝聚蛋白，有较强的嗜肝性,ConA可与多种细胞表面糖分子残基结合，激活T细胞分泌促炎细胞因子、趋化因子等细胞因子，引起由T细胞介导的肝脏损伤[9]。ConA可在很短时间内(8 h)导致小鼠肝脏T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞大量聚集，大量炎症细胞浸润会造成血液转氨酶明显升高[10]。免疫系统在肝炎的发病过程中起到重要作用，ConA诱导小鼠肝损伤模型就是通过活化T淋巴细胞引起免疫应答而致肝损伤，该模型与GaLN模型相比，更能真实模拟人类病毒性肝炎引发的免疫性肝损伤[11]。

从模型组及九味肝泰组小鼠成模8 h时HBV DNA定量分析来看，HBV DNA实时定量指标均为阳性，然后从尾静脉注射ConA试剂(12mg/kg)8 h，肝功能五项均显著升高，符合感染HBV后急性免疫性肝损伤情况，HBV DNA在复制时会破坏肝细胞，同时，ConA激活T细胞分泌促炎细胞因子、趋化性因子等细胞因子，引起由T细胞介导的肝脏损伤，此时肝细胞大量变性、坏死， 肝细胞膜通透性增加，胞内的转氨酶AST、TBil、GGT、TBA、ALT大量溢出到血浆中，转氨酶升高是急性肝损伤的重要判断指标[12]。在治疗7 d后，九味肝泰组小鼠AST、TBil、GGT、TBA、ALT基本恢复到对照组水平。九味肝泰由五味子、大黄(酒制)、姜黄、三七、郁金、蜈蚣、山药、黄芩和蒺藜等中药精制而成。其味苦气微，具有化瘀通络、健脾疏肝的作用，临床用于气滞血瘀兼肝郁脾虚患者[5]。九味肝泰组小鼠转氨酶降低应与九味肝泰活血化瘀，增加肝组织血流量，改善肝组织内微循环等作用有关[13]。本观察还发现，九味肝泰组小鼠在治疗7d后，MDA较模型组明显降低，SOD、GSH 明显增高，这提示九味肝泰可抑制刀豆蛋白A诱导急性免疫性肝损伤时的脂质过氧化反应，清除机体产生的氧自由基。组方中姜黄含有的姜黄素、三七的三七皂苷、大黄的大黄素等均能降低机体氧自由基，这可能是其机制之一[14]。

总之，九味肝泰可能通过抑制ConA诱导急性免疫性肝损伤时的脂质过氧化反应，促进肝功能恢复。但急性免疫性肝损伤是由T细胞介导而引起的，九味肝泰降酶机制复杂，也有可能通过抑制细胞凋亡，改善Thl和Th2免疫调节水平来达到降酶护肝的目的。但本实验未记录这方面的生化指标，其对细胞凋亡和T淋巴细胞功能的干预机制将在下一步进行研究。

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TheinterventionstudyonacuteimmuneC57BL/6JmiceliverinjurymodelofninekindsofGantaiinducedbytheConcanavalinA

DENGWei-ping1,ZhENGHong-mei2,LISheng-bao1,CHENDe-sen△etal.

1.Departmentofdigestivemedicine,ShiyanTaiheHospital(theAffiliatedHospitalofHubeiMedicalCollege)(Shiyan,Hubei,442000)China

2016-9-18 编辑：韦 怡)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.015

湖北省教育指导项目(No.B2016125)；△通讯作者，E-mail：dwpdenweipinjob@163.com