野生二粒小麦根中干旱响应蛋白的分离与鉴定

张 静，纪晓玲，杨 斌，白晓霞

(榆林学院生命科学学院，陕西榆林 719000)

野生二粒小麦根中干旱响应蛋白的分离与鉴定

张 静，纪晓玲，杨 斌，白晓霞

(榆林学院生命科学学院，陕西榆林 719000)

为了解野生二粒小麦响应干旱胁迫的调控机制，分析了干旱胁迫下小麦根的相对含水量、丙二醛、脯氨酸和过氧化氢含量，采用双向电泳(2-DE)结合MALDI-TOF-TOF-MS方法分离和鉴定了野生二粒小麦根中干旱响应蛋白的变化。结果表明，随着干旱处理时间的延长，野生二粒小麦根的相对含水量下降，脯氨酸含量先上升后降低，过氧化氢含量和丙二醛含量上升；复水后的野生二粒小麦根的相对含水量、脯氨酸含量有所升高，但未达到对照的水平。通过对干旱处理6 d后根系的总蛋白进行双向电泳分离和MALDI-TOF-TOF生物质谱鉴定，成功鉴定出26个差异表达蛋白，13个上调表达，13个下调表达。26个差异表达蛋白的功能主要涉及信号传导、氧化解毒、碳代谢、能量代谢、蛋白质生物合成及细胞骨架稳定。推测野生二粒小麦为适应干旱胁迫，通过根部感应胁迫信号，并传导至细胞内，影响小麦根中蛋白质的生物合成、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、细胞骨架形成；通过抗氧化酶系统和抗氧化物质的作用，将过多活性氧加以清除；通过增加胞内脯氨酸含量，降低根中水分损失。

野生二粒小麦；根；蛋白质组；干旱胁迫

Abstract: To understand the complex drought response mechanism inTriticumDicoccoides,the relative water,malondialdehyde(MDA),proline and hydrogen peroxide content changes in the root under drought stress were analyzed. 2-dimentional electrophoresis(2-DE) combined with MALDI-TOF-TOF analysis were adopted to isolate and identify drought responsive proteins in root ofTriticumDicoccoides. The results showed that the relative water content of roots was inhibited with the stress time prolonged. The proline content in root increased firstly,and then decreased while the increase of stress time. On the other hand,the H2O2and MDA content in root under drought stress were increased,indicating reactive oxygen species(ROS) resulted in the membrane lipid peroxidation or membrane breakup,thereafter lead to the increase of MDA,and the decrease of proline. Although the relative water content and proline content in root under rewatering was increased,it still could not recover to the control level. About 26 protein spots were successfully identified by 2-DE and MALDI-TOF-TOF analyses between control and stressed samples,including 13 up-regulated and 13 down-regulated proteins. Further analysis of these differential expressed proteins revealed that these proteins were mainly associated with signal transduction,oxidative detoxification,carbon metabolism,energy metabolism,protein synthesis and cytoskeleton stable. It was speculated that to response the drought,the root ofTriticumDicoccoidesfirstly sensed the drought signal,and then affected protein synthesis,amino metabolism,carbohydrate metabolism and cell cytoskeleton. The plus reactive oxygen species were eliminated by oxidative detoxification associated proteins. The water loss in root was decreased by enhancing proline content.

Keywords:TriticumDicoccoides; Root; Proteome; Drought stress

干旱是困扰世界农业发展的最主要的胁迫因子，特别是在干旱或半干旱地区。据纽约大学国家环境预报中心报道，随着地球表面变暖，16 ℃阈值温度带向极地方向移动，导致干旱地区面积自1948年以来已经增加了6%，预计到2050年，这一数值将至少增加8%[1]。大约50%的农业减产与水资源短缺有关[2]。植物为在干旱环境中求得生存、保持细胞内稳态，将会开启植物体自我保护机制，如过氧化物酶活性提高以清除过多的活性氧(Reactive Oxygen species，ROS)；提升细胞内脯氨酸含量、可溶性糖含量，以提高胞内渗透势，降低胞内水分损失；气孔关闭、降低光合活性、改变细胞壁弹性等[3]。在分子水平上看，植物响应干旱胁迫主要是改变一些基因的表达水平，从而使相应的功能蛋白表达水平发生变化，最终使其生物学功能发生改变以应对干旱胁迫[4]。由于植物大部分基因的功能未得到完全确定，干旱响应相关的基因信息仍然有限。

蛋白质是各种细胞功能的直接执行者，比较蛋白质组学技术已被广泛应用于植物抗逆胁迫机制的研究。前人在干旱胁迫下的小麦[5]、野生一粒小麦(Triticumboeoticum)[6]、一粒小麦(Triticummonococcum)[7]差异蛋白质组的研究中，已经分离鉴定出一些信号传导蛋白、氧化还原调控蛋白、氧胁迫解毒相关蛋白、蛋白质折叠与降解相关蛋白。野生二粒小麦是六倍体普通小麦A、B 染色体组的供体，是改良普通小麦农艺性状的重要种质资源库[8]。研究发现，野生二粒小麦的抗旱性强于普通小麦[9]。Peleg等[10]发现，野生二粒小麦的抗旱性具有遗传多样性，存在多态性的抗旱等位基因，且这种多态性与地域有关，某些地域(如以色列、中国西北部)来源的野生二粒小麦具有较强的耐旱性能。Kantar等[11]通过microRNA array技术分别分离鉴定了205和438个野生二粒小麦叶片、根部microRNA。然而，对野生二粒小麦耐旱相关蛋白质的研究较少。

本研究拟对干旱胁迫下的野生二粒小麦根部差异表达蛋白质进行探究，分析干旱胁迫3 d和6 d 以及复水后6 d根的过氧化氢含量、脯氨酸含量、丙二醛含量和相对含水量，以了解野生二粒小麦响应干旱胁迫的分子机制，为利用野生二粒小麦的优质抗旱基因提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设计

供试材料为野生二粒小麦(TriticumDicoccoides，种质编号：AS846)，由西北农林科技大学小麦研究中心提供。将种子放于垫有圆形滤纸的培养皿(直径20 cm)中，加适量水浸种2～3 d，使之萌发。将萌发一致的种子放于底部铺有塑料网的孔状泡沫中，移植于装有水的白色塑料盆中，置于16 h光/8 h暗、白天20℃/晚上8℃、相对湿度为65%～75%的温室中。在第三天，将长势一致的幼苗移栽至装有营养土的塑料盆中，充分供水。待长至两叶一心期(三叶期)分为四组进行不同处理，分别为对照组(正常浇水)、干旱处理3 d、干旱处理6 d、复水6 d(干旱处理6 d后正常供水6 d)，每组30盆，每盆10棵植株。用剪刀剪取不同处理材料根，并用蒸馏水快速浸洗干净，用滤纸将根部表面水吸干，部分用于相对含水量的测定，其余部分密封保存于-80 ℃冰箱备用。每个生理指标的测定及2-DE分析均至少3个生物学重复。

1.2 测定项目与方法

相对含水量的测定：参照Smart 等[12]的方法。丙二醛含量测定：参照 Hodges等[13]的方法。 脯氨酸含量测定：参照Bates等[14]的方法。H2O2含量测定：参照Hung等[15]的方法。

野生二粒小麦根总蛋白提取参照李鲜花等[16]的方法进行，将获得的蛋白干粉溶解于适量的裂解缓冲液[7 M尿素、2 M硫脲、4% CHAPS、65 mM Dithiothreitol( DTT )、微量蛋白质抑制剂]中，置于冰上2 h，然后在4 ℃、19 000 r·min-1离心1 h，取上清。采用Bradford[17]法对上清液进行蛋白浓度测定。对已测定浓度的蛋白质样品进行双向电泳分离，并对差异蛋白点进行生物质谱鉴定，操作步骤参考Liu 等[6]的方法进行。参考的数据库为NCBI绿色植物库(taxid:33090；336070 protein sequences；20170113)，蛋白质评分C.I.%超过95%以上的蛋白质认定为鉴定成功的蛋白。

1.3 数据处理

采用Excel 2003进行数据统计并作图，采用Duncan’s多重比较法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对野生二粒小麦根中生理生化指标的影响

由图1可知，野生二粒小麦根的相对含水量在对照、干旱胁迫3 d、6 d后分别为93.41%、74.01%、59.23%，干旱处理3 d和6 d后分别下降了19.30%和34.18%，根据Hsiao[18]对植物胁迫程度的划分，当植物组织相对含水量降低8%～10%左右时，属轻度干旱胁迫，降低10%～20%时，属中度干旱胁迫，而降低20%以上的则属重度干旱胁迫。说明随着处理时间的延长，对野生二粒小麦所造成的干旱胁迫程度由中度转为重度。在复水后6 d，野生二粒小麦根的相对含水量得到提升，为83.38%，但仍显著低于对照。

野生二粒小麦根中H2O2、MDA的含量随着干旱处理时间的延长而升高，在复水后，两者含量均有所下降(图1)。推测长时间干旱胁迫对野生二粒小麦根造成氧化胁迫，并使细胞膜脂质过氧化产物丙二醛增加，影响根细胞膜的稳定性。

野生二粒小麦根中的脯氨酸含量，在干旱处理3 d后由16.33 μg·g-1FW上升至31.51 μg·g-1FW，而在干旱处理6 d后，又下降至23.27 μg·g-1FW。推测在干旱处理早期，野生二粒小麦根可以通过提高细胞内脯氨酸含量抵抗干旱胁迫，随着干旱处理时间的延长，小麦根系统对干旱胁迫有所适应，胞内脯氨酸含量下降。

图柱上不同字母代表处理间差异在0.05水平显著。CK：正常浇水。

Letters above column indicates significant difference among treatments(P≤0.05).CK:Normal water.

图1不同处理下野生二粒小麦根相对含水量、脯氨酸含量、丙二醛含量与过氧化氢含量的变化

Fig.1Changesofcontentofrelativewater,proline,MDAandH2O2contentintherootofTriticumDicoccoidesunderdifferenttreatments

2.2 干旱胁迫对野生二粒小麦根中蛋白质组的影响

野生二粒小麦根蛋白质2-DE及MALDI-TOF-TOF结果(图2)表明，在对照和干旱处理组中，分别检测到465、447个重复性较好的蛋白点，其中，1.5倍以上的差异表达蛋白点有28个。通过MALDI-TOF-TOF生物质谱鉴定，共有26个差异蛋白点被鉴定成功，其中，有13个上调表达的蛋白，13个下调表达的蛋白(图2，表1)。这些差异蛋白质涉及干旱胁迫信号感应和传导、氧化解毒、蛋白质的生物合成与折叠、物质与能量代谢，以及细胞内外物质转运，其中，上调表达的蛋白质主要涉及信号传导、氧化解毒与细胞内外物质转运，表明这些生物学过程在干旱胁迫下的野生二粒小麦根中得到增强；干旱胁迫影响了根细胞蛋白质合成与折叠、物质与能量代谢等过程。

图2 干旱胁迫下野生二粒小麦根蛋白质2-DE分离结果

3 讨 论

研究发现，干旱胁迫可诱导植物组织细胞中ROS含量的上升，攻击细胞膜、DNA、蛋白质等，并使细胞膜脂质过氧化，导致细胞膜脂质过氧化产物丙二醛含量上升[19]。本研究发现，野生二粒小麦在干旱胁迫后，根系中过氧化氢与丙二醛含量随着干旱处理时间的延长而上升，表明干旱处理可导致野生二粒小麦根部细胞膜因脂质过氧化而受到损伤。

脯氨酸是植物体内一种重要的渗透调节物质，高含量脯氨酸可维持逆境胁迫下植物细胞水势平衡，提升植物抗逆能力[20]。野生二粒小麦根的脯氨酸含量在干旱胁迫3 d后上升，在干旱6 d后下降，其原因可能是随着干旱胁迫时间的延长，野生二粒小麦通过调节自身代谢适应以干旱胁迫，也可能因干旱程度由中度向重度转变，膜脂质过氧化程度过高使根细胞遭到破坏，导致胞内脯氨酸、蛋白质等营养物质流失，从而导致干旱处理6 d后的野生二粒小麦根中脯氨酸含量下降。

本研究中，有些蛋白点，如凝集素(蛋白点1和2)、肌动蛋白(蛋白点14和15)，在2-DE胶图中显示的位置不同，但是鉴定结果为同种蛋白。类似的结果在干旱处理后的野生一粒小麦[6]中也有发现，推测这些蛋白质在干旱胁迫后发生转录后修饰或者降解。

本研究中分离的2个凝集素蛋白(表1，蛋白点1和2)在干旱胁迫后6 d的野生二粒小麦根中显著上调表达。研究表明，植物凝集素可能参与信号传导过程[21]。因此，推测凝集素在野生二粒干旱胁迫响应过程中的作用是通过调控细胞学过程或信号传导，调控干旱响应相关蛋白的表达，以维持植物细胞的正常生长、发育和代谢，从而缓解干旱处理对野生二粒小麦所造成的危害。

干旱胁迫下植物中活性醛含量会显著上升，进而破坏细胞膜，使之脂质过氧化，引起丙二醛含量的上升[22]。为抵御干旱胁迫，植物通常会采取两种措施对活性氧、活性醛加以清除，即酶促反应和非酶促反应[23]。

本研究中，干旱胁迫下的野生二粒小麦根中，Cu/Zn SOD(蛋白点5和蛋白点8)和乙醛还原酶(蛋白点3)显著上调表达。Hegeds等[24]研究表明，Cu/Zn SOD可解除低温、镉、干旱、紫外胁迫下转基因烟草中脂质过氧化产物的剧毒性，如4-羟基壬烯醛。因此，Cu/Zn SOD和乙醛还原酶在干旱胁迫下的野生二粒小麦根中的上调表达，表明酶促反应在野生二粒小麦根干旱响应过程中发挥了作用。

黄酮类物质是一类多酚类次级代谢物质，可促进植物体内活性氧的清除。查尔酮异构酶是黄酮类物质合成过程中的关键酶，可将查尔酮异构化形成类黄酮柚苷配基[25]。本研究中，在干旱胁迫下查尔酮异构酶(蛋白点11)显著下调表达，表明非酶促清除ROS过程在重度干旱胁迫的野生二粒小麦根中受到影响。

氧化还原酶可催化许多参与细胞学过程的底物的氧化还原反应，这些过程包括信号传导、代谢通路、胁迫防御反应等[26]。本研究发现，干旱胁迫可导致氧化还原酶X1亚型(蛋白点9)的表达量上升，这种酶含有NADB Rossmann 结构域和Gfo_IDH_MocA_C (葡萄糖、果糖氧化还原酶)结构域，含有这两种结构域的蛋白在碳代谢和能量代谢过程中具有重要作用，因此，它的上调表达表明干旱胁迫对野生二粒小麦根的代谢通路产生了影响。

烯醇酶可诱导碳代谢过程从氧化途径(oxidative pathway)转移至发酵途径(fermentative pathway)，是一种糖酵解关键酶[27]。干旱胁迫下的野生二粒小麦根中，烯醇酶1(蛋白点10)和碳代谢过程中伴随的能量代谢物质ATP合成相关酶(蛋白点22与24)的表达量均显著下调，表明干旱胁迫影响了小麦碳代谢和能量代谢过程。

蛋氨酸是S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基供体，甲硫氨酸合酶是催化甲硫氨酸合成的关键蛋白酶，该蛋白在干旱胁迫下的野生一粒小麦根中被诱导表达，以供植物在逆境胁迫下的生长所需[6]。野生二粒小麦根中甲硫氨酸合酶(蛋白点18与19)在干旱胁迫后表达量显著上升，表明干旱处理促进了甲硫氨酸的合成，以供应许多代谢反应所需的基础物质。

蛋白质合成是受干旱胁迫影响主要的代谢过程之一。干旱胁迫下野生二粒小麦根中的翻译起始因子 IF-2(蛋白点17)的表达受到抑制，热激蛋白90(蛋白点16)也下调表达。盐胁迫处理的小麦根中，蛋白质合成相关蛋白下调表达，而热激蛋白的表达水平上升，以应对逆境胁迫[28]。在干旱处理的野生一粒小麦根中蛋白质合成相关蛋白与热激蛋白均下调表达[6]。这两类蛋白在逆境胁迫下的不同品种小麦中表达水平的差异，表明不同小麦品种对不同逆境胁迫的响应机制存在一定差异。

高等植物液泡膜中的V-ATPase是一种复杂的多亚基酶，在逆境胁迫下的植物中，比如干旱胁迫下的绿豆根中，V-ATPas表达量有所上升，对跨膜电化学质子梯度的建立和维持起着主要作用，为物质在膜内外的运输提供牵动力，以维持植物在逆境胁迫下的内稳态[29]。本研究中，共发现有2个V-ATPase亚基(蛋白点4和23)在干旱胁迫下的野生二粒小麦根中上调表达(表1)，从而提升了野生二粒小麦在干旱胁迫中的物质转运能力。

肌动蛋白和微管蛋白是重要的细胞骨架蛋白，在胞质环流、细胞形状、细胞分裂、细胞器移动以及细胞延伸生长过程中起着重要作用[30]。野生一粒小麦根在干旱处理后，actin-4的表达水平受到显著抑制[6]。本试验发现，有两个微管发育相关蛋白(蛋白点12与13)和两个肌动蛋白(蛋白点14与15)在干旱胁迫后野生二粒小麦根中下调表达(表1)，表明干旱胁迫导致野生二粒小麦的根细胞生长、分裂等过程受到抑制。

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IsolationandIdentificationofDroughtStressResponsiveProteinsinRootofTriticumDicoccoides

ZHANGJing，JIXiaoling,YANGBin,BAIXiaoxia
(College of Life Science,College of Yulin,Yulin,Shaanxi 719000,China)

时间：2017-09-13

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170913.1138.008.html

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)09-1167-07

2017-01-26

2017-04-08

榆林市科学技术局科技计划项目(2014cxy-10)；榆林学院教改项目(JG1533)；陕西省科技厅重点科技创新团队项目(2013KCT-29)；陕西省教育厅科研计划项目(15JK1848)

E-mail：ylzjing@163.com