基于银纳米粒子的荧光增强法测定依诺沙星

李满秀*， 王 磊, 杜丽娟, 贺彩虹

(忻州师范学院化学系，山西忻州 034000)

依诺沙星(ENX)是第三代氟喹诺酮类抗生素，具有杀菌作用强、抗菌活性高、吸收迅速完全、不良反应少等优点，临床主要用于对其敏感的革兰阴性菌和阳性菌引起的感染，如泌尿、肠道、呼吸道、外科等感染性疾病。目前，用于依诺沙星的测定方法包括分光光度法、伏安法、高效液相色谱法、化学发光法和荧光分析法等[1 - 5]。现有测定方法有各自的局限，新方法的研究仍具有现实意义。

银纳米粒子(AgNPs)体积小、比表面积大，具有独特的量子尺寸效应、良好的抗菌性、生物兼容性及表面易修饰等优点,因此AgNPs的研究近年来深受人们的关注[6 - 9]。迄今尚未见利用AgNPs测定依诺沙星的方法报道。本文室温下制备聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液，用荧光、紫外光谱等进行表征，研究发现依诺沙星与AgNPs相互作用后,可增强AgNPs溶液的荧光强度，以此建立了测定依诺沙星的新方法，实现对依诺沙星的定量检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4500型荧光分光光度计(日本，日立公司)；UV-2550型紫外分光光度计(日本，岛津公司)；pHS-3B型酸度计(上海精密科学仪器有限公司)；78-2型磁力加热搅拌器 (江苏金坛金城国盛实验仪器厂)；HK-2A超级恒温水浴箱(南京南大万和科技有限公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

AgNO3、聚乙烯吡咯烷酮K-30、NaBH4(国药集团化学试剂有限公司)，聚乙二醇400、Na2HPO4(天津化学试剂三厂)，NaH2PO4(天津申泰化学试剂有限公司)，依诺沙星(东京化成工业株式会社)。NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液：由0.2 mol/L Na2HPO4溶液和0.3 mol/L NaH2PO4溶液混合制备，酸度计调节pH值。所用试剂为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验步骤

1.2.1AgNPs的制备向100 mL烧杯中依次加入48.5 mL水，0.5 mL的0.01 mol/L AgNO3溶液，0.5 mL 4 g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30溶液，在25 ℃水浴中搅拌25 min后，再加入0.5 mL 4 g/L NaBH4溶液，继续搅拌10 min，可制得1.0×10-4mol/L的聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液，将其倒入60 mL棕色小滴瓶中，置于冰箱中冷藏保存。

1.2.2紫外吸收光谱的测定在10 mL比色管中，依次加入2.0 mL的AgNPs溶液，0.3 mL的聚乙二醇和1.0 mL不同浓度的依诺沙星标准溶液，用pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至5 mL，室温下反应20 min后，在280～700 nm波长范围内测定其紫外吸收光谱。

1.2.3荧光光谱的测定在10 mL比色管中，依次加入2.0 mL的AgNPs溶液，0.3 mL聚乙二醇和1.0 mL不同浓度的依诺沙星标准溶液，用pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至5 mL，室温下反应20 min后，在λex/λem=337/380 nm处测定其荧光强度(激发和发射狭缝宽度均为10 nm)。

2 结果与讨论

2.1 AgNPs与依诺沙星作用效果与机理探讨

AgNPs与依诺沙星作用的荧光光谱如图1所示。以荧光强度的比值(F/F0)对依诺沙星的浓度进行数据拟合，发现依诺沙星浓度在4.0×10-7～1.0×10-5mol/L范围内与F/F0呈现出良好的线性关系(其中：F为加入依诺沙星后体系的荧光强度；F0不加依诺沙星时体系的荧光强度)，且F/F0随依诺沙星浓度的增大而增加，符合Stern-Volmer方程，线性方程为：F/F0=1.0241+0.1576c(μmol/L)，相关系数为0.9994。聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液中加入依诺沙星溶液，荧光强度明显增强，此现象可能与加入依诺沙星后AgNPs颗粒变小的结果相关，在一定浓度依诺沙星存在时，引起AgNPs聚集，发生明显表面键合、腐蚀作用，颗粒尺寸减小，表现出明显量子尺寸效应，导致体系荧光信号显著增强。

AgNPs与依诺沙星作用的紫外吸收光谱如图2所示。以AgNPs体系382 nm处吸光度对依诺沙星浓度进行数据拟合，发现依诺沙星浓度在4.0×10-7～1.0×10-5mol/L范围内与吸光度呈现良好的线性关系，且吸光度随依诺沙星浓度的增大而减小，符合Stern-Volmer方程，线性回归方程为：A=-0.0614c+0.7667，相关系数为0.9993。AgNPs溶液中加入依诺沙星后，体系的吸光度明显降低，其原因可能是：聚乙烯吡咯烷酮作为保护剂制备AgNPs的过程中,主要是通过分子中大量羟基和酰胺基团与金属表面产生化学吸附包裹于金属表面,从而实现保护作用，使得AgNPs在水溶液中呈均一的稳定分散状态。当加入依诺沙星溶液后，打破了原本稳定的分散状态，致使AgNPs产生团聚。AgNPs之间的距离变小，其表面等离子体共振吸收发生变化，382 nm处的吸收明显降低。

图1 AgNPs与依诺沙星相互作用的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of AgNPs and enoxacin’s interaction cEMX:1-6:0,0.4,0.8,2.0,4.0,10 μmol/L.

图2 AgNPs与依诺沙星相互作用的紫外吸收光谱Fig.2 UV absorption spectra of AgNPs and enoxacin’s interaction cENX:1-6:0,0.4,0.8,2.0,4.0,10 μmol/L.

图3 pH对AgNPs体系荧光强度的影响Fig.3 Effect of pH on the fluorescence intensity of AgNPs

2.2 pH值的影响

按照实验方法，选择pH分别为5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液进行实验。结果表明，在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液与依诺沙星作用最强，实验选择体系的pH=7.4。

2.3 聚乙二醇用量的影响

按照实验方法，探讨了聚乙二醇用量对体系的影响。分别在体系中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL聚乙二醇，测定AgNPs溶液的荧光强度，测定值为159、164、182、161、156，表明聚乙二醇用量为0.3 mL时效果最佳。

2.4 AgNPs用量的影响

AgNPs溶液加入量直接影响依诺沙星检测的灵敏度和线性范围，实验探讨了不同AgNPs溶液加入量对依诺沙星检测效果的影响。分别加入0.5～2.5 mL AgNPs溶液进行实验，结果发现随着AgNPs溶液用量增加，荧光强度逐渐增大，2.0 mL时荧光强度最大。实验选择AgNPs溶液用量为2.0 mL。

2.5 反应时间及温度影响

按照实验方法，分别反应10、20、30、40、50、60、90、120 min 后进行测定。结果表明，在20 min后聚乙烯吡咯烷酮AgNPs溶液与依诺沙星作用稳定，体系的荧光强度基本不变，实验选择20 min后进行测定。按照实验方法，分别在15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃时进行测定。结果表明随着反应温度的升高，反应体系荧光强度不断下降。但在15～25 ℃之间，荧光强度变化较小，实验选择常温下操作。

2.6 干扰试验

2.7 工作曲线、检出限及精密度

依诺沙星浓度在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L范围内与体系F/F0呈现良好的线性关系，线性方程为：F/F0=1.1131+0.0942c(μmol/L)，相关系数为0.9956，该方法的检出限为8.0×10-8mol/L(检出限按3δ/k来计算;δ为连续测定10个空白溶液的标准偏差，k为线性方程的斜率)。对10份1.0×10-6mol/L依诺沙星溶液测定，其相对标准偏差(RSD)为2.4%。

2.8 样品测定

称取1.0 g依诺沙星胶囊，用乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中备用。取口服依诺沙星片200 mg 的健康受试者2 h后的尿样,经3 800 r/min离心10 min 后,准确移取10 mL于50 mL容量瓶中,用水稀释至刻度备用。

采用标准加入法分别测定依诺沙星胶囊和尿样中依诺沙星的含量。分别取处理好的样品溶液平行测定5组并求平均值，代入标准曲线计算样品中依诺沙星含量，然后加入三种不同浓度的的依诺沙星标准溶液进行加标实验，利用标准曲线计算回收率。结果如表1所示。胶囊样品根据其测定浓度计算出胶囊中依诺沙星为189 毫克/粒，与标示值(200 毫克/粒)一致。

表1 样品分析结果(n=5)

3 结论

研究了依诺沙星与银纳米粒子的相互作用,初步探讨了其作用机理,建立了测定依诺沙星的新方法。方法用于药品和尿样中依诺沙星含量测定,结果令人满意。该方法仪器要求简单,操作简便快速,灵敏度高,可为药品质量检测及银纳米粒子的应用提供有益的参考。