正交试验优化新疆芫荽中总黄酮提取工艺

2017-10-14阿依古丽·塔什波拉提故丽巴哈·艾合买提阿不力孜·艾力

安徽农业科学 2017年22期

阿依古丽·塔什波拉提故丽巴哈·艾合买提阿不力孜·艾力

摘要[目的]优化新疆芫荽中总黄酮提取工艺。[方法]以新疆芫荽地上部分为原料，采用单因素试验和正交试验设计，以紫外分光光度法测定提取液中总黄酮提取率。[结果]新疆芫荽地上部分总黄酮优化后提取工艺：提取溶剂（乙醇）浓度为40%，提取时间为120 min，固液比为1∶15，提取温度为60 ℃，粒度为40目，提取次数为2。在上述工艺条件下，黄酮提取率达3.28%。[结论]采用正交试验设计优化后的新疆芫荽地上部分总黄酮的提取工艺是合理可行的。

关键词新疆芫荽；醇提取工艺；总黄酮；紫外可见光谱仪

中图分类号S573+.2文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）22-0001-04

Abstract[Objective] The aim was to optimize technological parameters for extraction of total flavonoids from Coriandrum sativum L.. [Method] Aerial parts of Coriandrum sativum L. as raw material， using single factor experiment and orthogonal experiment design， the extraction ratio of total flavonoids from the Coriandrum sativum L. was deter mined by UVVis spectrophotometry， and the technology parameters of extraction of total flavonoids from the Coriandrum sativum L. were studied. [Result] The optimal extraction process conditions were as followed： 40% of solvent concentration， 120 min of extraction time， 1∶20 of solidliquid ratio， 60 ℃ of extraction temperature， 40 mesh of material size and twice extraction， above the optimal conditions， the extraction ratio of total flavonoids from the Coriandrum sativum L. was 3.28%. [Conclusion] The optimized technological parameters for extraction of total flavonoids from Coriandrum sativum L. by orthogonal experiment is reasonable and feasible.

Key wordsCoriandrum sativum L.；Ethanol extraction process；Total flavone；Uvvis spectrophotometry

芫荽（Coriandrum sativum L.），俗稱香菜，又名胡荽，属伞形科植物，为一年生草本植物，高20～60 cm，全株无毛，茎直立，中空，具细条棱[1]，是作为药用和调味食品较古老的芳香蔬菜之一，原产地中海沿岸等地。

芫荽的叶、根茎、籽均可入药。中医以全草入药，性温，味辛，功能解表，透发麻疹，内有驱风、健胃和刺激的作用，主要用于治疗麻疹、消化不良、感冒风寒、流行性感冒、发热头痛、痢疾下血和高血压，外用有镇痛效果，还对某些食物中毒有解毒作用[2]。芫荽的上述治病功能与其含有的化学成分密切相关，芫荽全草富含蛋白质、脂肪、糖类、胡萝卜素、维生素B1等营养物质[3]，含有钙、磷、钾、钠、镁、锌等矿物质及铜、锰、硒等稀有金属[4]，同时含有多种氨基酸[5]，其中胡萝卜素和铁的含量较高，是番茄、黄瓜、菜豆的10倍以上，钙、铁含量也高于其他蔬菜[6]。

黄酮类化合物具有许多有益的生理效应与药理作用，越来越引起人们的重视。黄酮类化合物的生理活性作用较广泛，具有生物抗氧化性、清除自由基作用、抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂降血压作用、降低血糖作用、抗癌作用、镇痛作用、免疫作用、抗炎作用、抗菌作用、对消化性溃疡的保护作用等药用保健功能[7-11]。目前，国内外主要是从银杏叶、大豆、山楂叶、荷叶、芹菜叶、水芹、花生壳、芝麻叶等材料中提取黄酮类化合物，而对新疆芫荽地上部分的研究鲜见报道。为此，笔者以新疆芫荽地上部分中总黄酮（以芦丁计）得率为评价指标，采用单因素和正交试验优化了芫荽中总黄酮提取工艺，用紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量，建立了新疆芫荽地上部分中总黄酮提取较佳工艺条件，以期为新疆芫荽资源的综合开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料。芫荽的地上部分：6月底一次性采自喀什市，除掉黄叶和根，洗净，在干燥阴凉处（室温）晾干，置于55 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，过40目标准筛（粒径0.42 mm），置于封口塑料袋中，放入干燥器备用。

1.1.2试剂。芦丁：生化试剂（含量≥95%），上海试剂二厂生产；甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、硝酸铝[Al（NO3）3]、氢氧化钠（NaOH）、亚硝酸钠（NaNO2）均为分析纯。

1.1.3主要仪器。DYQ-188型流水式粉碎机（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；721分光光度计（上海第三分析仪器厂）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（上海东玺制冷仪器设备有限公司）；GM-0.5B型隔膜真空泵（天津市津騰实验设备有限公司）；正交试验数据统计分析用学韬软件工作室的正交设计助手软件 version 3.1。

1.2方法

1.2.1提取工艺流程。芫荽地上部分→去根，除杂，洗净，沥干水→烘干（60 ℃）→粉碎→过筛→乙醇加热回流提取→减压真空抽滤→滤液减压旋转蒸馏浓缩→石油醚脱色→弃去石油醚层→收集乙醇层→定容，得总黄酮粗提取液。

1.2.2芦丁标准溶液的配制。称取芦丁对照品0.052 2 g，用无水乙醇溶解，定容至100 mL，得浓度为0.522 0 mg/mL的芦丁对照品溶液。吸取芦丁对照品溶液5.00 mL，用30%乙醇定容至25 mL，得浓度为0.104 4 mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.2.3标准曲线的绘制[8]。吸取“1.2.2”芦丁对照品溶液（0.104 4 mg/mL）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入4% NaOH溶液4.0 mL，用30%乙醇定容，摇匀，以30%乙醇为空白参比，15 min后用1 cm比色皿于510 nm波长处测定吸光度（A），以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到芦丁含量Y（μg/mL）与吸光度A之间的回归方程：Y=0.012 5A-0.005 9，相关系数R2=0.999 5（图1）。

1.2.4芫荽总黄酮粗体液的提取。将芫荽地上部分去根、发黄叶和枯叶，用去离子水洗净，沥干水，60 ℃恒温烘箱烘干，中药粉碎机粉碎，过60目筛，得到芫荽干燥粉末。取一定量原料干粉，采用一定体积分数的乙醇按一定的固液比在一定温度下回流提取，重复提取1次，合并2次提取液，真空减压抽滤，滤液用真空旋转蒸发仪浓缩后，转移到分液漏斗中，加入一定量石油醚振摇进行脱色，弃去石油醚层，收集乙醇层于棕色玻璃瓶中，该提取液为芫荽总黄酮提取液。

1.2.5芫荽粗提液中总黄酮含量的测定。参照文献[9]，取1.0 mL提取液，按照“1.2.3”的方法在510 nm波長处测定样品吸光度，从工作曲线中查出吸光度对应的总黄酮浓度，由回归方程可得样品浓度C和样品吸光度A的关系式：C=80.0A-0.472。通过样品浓度计算总黄酮提取率（X）：

X=（80.0A-0.472）×稀释倍数×提取液体积芫荽重量×106×100%

1.2.6单因素试验。以芫荽地上部分中总黄酮提取率为指标，分别考察原料粒度、提取溶剂种类、乙醇浓度、固液比、提取温度、提取时间、提取次数7个因素对芫荽总黄酮提取效果的影响。单因素试验因素及水平见表1。

1.2.6.1提取溶剂的考察。称量5.00 g芫荽样品粉末干品（60目）4份，分别置于4个磨口三角瓶中，在恒定固液比1∶10、提取温度60℃、提取时间120min的条件下，分别使用水、

甲醇、乙醇、丙酮为提取溶剂，回流提取。提取液按照“1.2.4”处理得样品待测溶液，按照“1.2.3”测定其总黄酮含量，计算总黄酮提取率，确定最佳提取溶剂。

1.2.6.2乙醇浓度的考察。称取5.00 g芫荽样品粉末干品（60目）6份，分别置于6个磨口三角瓶中，在恒定固液比1∶10、提取温度60 ℃、提取时间120 min的条件下，分别用不同浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）乙醇溶液作提取溶剂，回流提取。每份样品回流提取2次，合并2次提取液。提取液按照“1.2.4”处理得样品待测溶液，按照“1.2.3”测定其总黄酮含量，计算总黄酮提取率，确定最佳提取溶剂浓度。

1.2.6.3提取时间的考察。称取5.00 g芫荽样品粉末干品（60目）5份，分别置于5个磨口三角瓶中，在恒定固液比1∶10、浓度为50%的乙醇溶液作为提取剂、提取温度60 ℃的条件下，分别设40、80、120、160、200 min 5个时间梯度，回流提取。每份样品回流提取2次，合并2次提取液。提取液按照“1.2.4”处理得样品待测溶液，按照“1.2.3”测定其总黄酮含量，计算总黄酮提取率，确定最佳提取时间。

1.2.6.4固液比的考察。称取5.00 g芫荽样品粉末干品（60目）5份，分别置于5个磨口三角瓶中，在浓度为50%的乙醇溶液为提取剂、提取温度60 ℃、提取时间120 min的条件下，分别设1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 5个固液比梯度，回流提取。每份样品回流提取2次，合并2次提取液。提取液按照“1.2.4”处理得样品待测溶液，按照“1.2.3”测定其总黄酮含量，计算总黄酮提取率，确定最佳固液比。

1.2.6.5提取温度的考察。称取5.00 g芫荽样品粉末干品（40目）6份，在固液比1∶20、50%乙醇的条件下分别于50、60、70、80、90、100 ℃下提取120 min。每份样品回流提取2次，合并2次提取液。提取液按照“1.2.4”处理得样品待测溶液，按照“1.2.3”测定其总黄酮含量，计算总黄酮提取率，确定最佳提取温度。

1.2.6.6原料粉碎粒度的考察。称取5.00 g芫荽样品粉末干品5份，分别置于5个磨口三角瓶中，在以固液比1∶10的浓度为50%的乙醇为提取溶剂、提取温度60 ℃、提取时间120 min的条件下，分别设20、40、60、80、100目5个粉碎粒度，回流提取。提取液按照“1.2.4”处理得样品待测溶液，按“1.2.3”测定其总黄酮含量，计算总黄酮提取率，确定最佳原料粉碎粒度。

1.2.6.7提取次数的考察。称取5.00 g芫荽样品粉末干品（60目）4份，分别置于4个磨口三角瓶中，在以恒定固液比1∶20的浓度为50%的乙醇为提取溶剂、提取温度60 ℃、提取时间120 min的条件下，分别设1、2、3、4次4个提取次数，回流提取。提取液按照“1.2.4”处理得样品待测溶液，按“1.2.3”测定其总黄酮含量，計算总黄酮提取率，确定最佳提取次数。

1.2.7正交试验。根据单因素试验结果，选取影响较显著的4个因素，设计4因素3水平L9（3）4正交试验，进一步优化芫荽总黄酮乙醇提取工艺。

45卷22期阿依古丽·塔什波拉提等正交试验优化新疆芫荽中总黄酮提取工艺

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1提取溶剂对总黄酮提取率的影响。由图2可知，在相同条件下，乙醇和甲醇对芫荽总黄酮的提取效果较好，二次水次之，丙酮较差。从食品安全性、环保等因素综合考虑，选用乙醇作溶剂较适宜。

2.1.2乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。由图3可见，乙醇浓度在40%～50%时，黄酮提取率随着乙醇浓度的增加而增加，乙醇浓度为50%时黄酮提取率最高，乙醇浓度超过50%时黄酮提取率逐渐下降。从产业化成本的角度考虑，乙醇浓度选用40%、50%、60%进行正交试验。

2.1.3提取时间对总黄酮提取率的影响。由图4可见，随着提取时间的增加，芫荽总黄酮提取率呈现出先增加后降低的趋势，提取时间增加到120 min时，总黄酮提取较完全，所以提取时间选用80、120、160 min进行正交试验。

2.1.4固液比对总黄酮提取率的影响。由图5可知，在其他因素固定的条件下，当固液比为1∶20时芫荽总黄酮提取率增加幅度较显著，固液比超过1∶20时总黄酮提取率反而有所下降。从产业化生产成本和能耗控制角度考虑，固液比选用1∶10、1∶20、1∶30进行正交试验。

2.1.5提取温度对总黄酮提取率的影响。由图6可见，当提取温度在50～60 ℃时芫荽总黄酮提取率随着提取温度的升高而增加，提取温度为60 ℃时黄酮提取率较高，当提取温度达到并超过70 ℃时，总黄酮提取率逐渐降低。究其原因可能是芫荽所含的黄酮类化合物热稳定性不佳，导致在较高温度范围内总黄酮提取率逐渐降低。从产业化生产成本和能耗控制角度考虑，提取温度选用50、60、70 ℃进行正交试验。

2.1.6原料粉碎粒度对总黄酮提取率的影响。由图7可知，芫荽总黄酮提取率随着原料粉碎粒度的增加而增加，原料粉碎粒度在20～60目时总黄酮提取率增加显著，60目时总黄酮提取率较高，当原料粉碎粒度超过60目时总黄酮提取率增加不明显，因此，确定60目为最佳原料粒度。

2.1.7提取次數对总黄酮提取率的影响。由图8可知，随着提取次数的增加，总黄酮提取率提高，当提取次数超过2次时，总黄酮提取率增加幅度不明显。因此，确定最佳提取次数为2次。

2.2正交试验结果

根据单因素试验结果，选取乙醇浓度、提取温度、固液比和提取时间4个因素，采用4因素3水平正交试验，对芫荽总黄酮乙醇回流提取工艺进行优化。正交试验各因素及水平见表2。

由表3可知，4个因素对芫荽地上部分总黄酮提取率的影响从大到小排序为提取温度、乙醇浓度、固液比、提取时间，最佳的工艺条件组合为A1B1C2D3，即乙醇浓度为40%，提取温度为60 ℃，固液比为1∶15，提取时间为120 min。

方差分析表明，选定的4个因素对芫荽地上部分总黄酮得率影响均不显著。因此，在工艺条件优化中要综合考虑生产成本、劳动强度和生产速度等因素，制定科学合理的工艺参数，可获得较高的提取效果。

2.3工艺验证试验结果

通过正交试验获得新疆芫荽地上部分中总黄酮最佳提取工艺为A1B1C2D3，依据该工艺进行验证试验，重复4次，4次提取率分别为3.16%、3.23%、3.34%和3.38%，计算得平均提取率为3.28%，表明优化后工艺条件是稳定有效的，提取工艺是合理可行的。

3结论与讨论

通过单因素试验较全面地考察了原料粒度、溶剂类型、乙醇浓度、固液比、提取温度、提取时间、提取次数对芫荽总黄酮提取率的影响，根据单因素试验结果确定正交试验因素及水平。通过4因素3水平正交试验对新疆芫荽地上部分中总黄酮提取工艺进行了优化，得出最佳的工艺参数为：乙醇浓度40%，提取温度60 ℃，固液比1∶15，提取时间120 min。

提取温度和乙醇浓度对新疆芫荽地上部分总黄酮提取率的影响较明显，固液比、提取时间的影响不明显。

在最佳工艺条件下新疆芫荽地上部分中总黄酮（以芦丁计）得率达3.28%。该法与王顺民等[12] 的超声波协同乙醇-硫酸铵双水相体系提取法相比，总黄酮提取率提高了16%，与乙醇回流法[13]相比总黄酮提取率提高了28%，并且用95%乙醇、沸水浴回流提取4次，工业化生产成本相对较高；而该法使用石油醚[13]对初提的总黄酮浓缩液进行除脂、脱色，消除了色素和脂类物质对黄酮含量测定的干扰，确保了黄酮含量的准确度和可靠性，可为新疆芫荽资源的精细加工提供参考。

参考文献

[1]

刘永民.维吾尔药志：上册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：215.

[2] 柴玉花.美味良药话香菜[J].蔬菜，2002（1）：40.

[3] 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所.食物成分表：全国分省值[M].北京：北京人民卫生出版社，1999.

[4] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1975.

[5] VASI I G，KALINTHA B P.Aminoacid composition of leafy vegetables[J]. J Inst Chemists，1980，152： 13-16.

[6] 罗富英，张伟国.新型植物调节剂在芫荽制种生产上的应用研究[J].种子，2005，24（11）：84-85.

[7] 郭红转，陆占国，李健.芫荽的研究开发现状[J].食品研究与开发，2005，26（2）：104-106.

[8] 李小梅，张丽茁，张景涛.芫荽营养与药理作用研究[J].黑龙江农业科学，2010（3）：121-123.

[9] 黄泽元，王海滨，刘志伟.芝麻叶中总黄酮的最佳提取工艺研究[J].农业工程学报，2004，20（6）：201-204.

[10] 华辉，郭勇.黄酮类化合物药理研究进展[J].广东药学，1999，9（4）：9-12.