细胞外信号蛋白调节激酶5在异氟醚后处理减轻大鼠海马脑片缺氧无糖损伤中的作用*

崔迪，王胜，葛明月，王芹，殷姜文，代志刚，司军强

（1.石河子大学医学院第一附属医院 麻醉科，新疆 石河子832008；2.石河子大学医学院 生理教研室，新疆 石河子 832000）

细胞外信号蛋白调节激酶5在异氟醚后处理减轻大鼠海马脑片缺氧无糖损伤中的作用*

崔迪1，王胜1，葛明月1，王芹1，殷姜文1，代志刚1，司军强2

（1.石河子大学医学院第一附属医院 麻醉科，新疆 石河子832008；2.石河子大学医学院 生理教研室，新疆 石河子 832000）

目的探讨异氟醚后处理大鼠海马脑片缺氧无糖（OGD）损伤神经保护机制中细胞外信号蛋白调节激酶5（ERK5）的作用。方法使用雄性SD大鼠，将其麻醉后取出海马组织，制成离体脑片，然后随机进行正常对照组（Con组）、损伤组（OGD组）和药物处理组的处理。采用花粉活力染色（TTC）法评价各组脑片损伤程度，采用碘化丙啶（PI）染色法检测海马CA1区神经细胞凋亡程度，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定细胞外调节蛋白激酶信使核糖核酸（ERK5 mRNA）的表达，采用Western blot法检测ERK5蛋白的表达与磷酸化水平。结果与Con组比较，OGD组脑片损伤程度升高、海马CA1区凋亡细胞增多，海马组织内ERK5 mRNA和p-ERK5表达升高（P＜0.05）；XMD组阻断ERK5 mRNA和p-ERK5表达，脑片损伤程度升高、海马CA1区凋亡细胞增多（P＜0.05）。与OGD、1.5%ISPOC和4.5%ISPOC组比较，3.0%ISPOC组脑片损伤程度减轻、海马CA1区凋亡细胞减少，海马组织内ERK5 mRNA和p-ERK5表达升高（P＜0.05）。与3.0%ISPOC组比较，XMD阻断ISPOC海马组织内ERK5 mRNA和p-ERK5表达，脑片损伤程度升高、海马CA1区凋亡细胞增多（P＜0.05）。结论一定浓度的异氟醚后处理大鼠海马脑片对抗OGD损伤的保护性机制可能与上调ERK5 mRNA和ERK5磷酸化水平有关。

麻醉药；异氟醚后处理；细胞外信号调节MAP激酶类；脑缺血；海马

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of extracellular signal-regulated protein kinase 5 (ERK5)on Isoflurane posttreatment-mediated decrease of hippocampal injury in rat models of oxygen-glucose deprivation(OGD).MethodsMale SD rats were randomly divided into four groups:the normal control(Con)group,the OGD group,the XMD group,and the ISPOC group.Rats were anesthetized followed by harvest of the hippocampus for further preparation of tissue slices.Histological analysis of hippocampus was achieved by 2%2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)staining.Neuronal apoptosis in hippocampus CA1 region wasanalyzed by propidium iodide(PI)fluorescence staining.The expression level of ERK5 mRNA was determined by real-time fluorescent PCR.The ERK5 protein expression and phosphorylation were detected by Western blot.ResultsCompared with the Con group,the degree of hippocampal injury,apoptosis rate in hippocampal CA1 region and the expression levels of ERK5 mRNA and p-ERK5 in the OGD group were increased significantly (P＜0.05).In the XMD group,the expression levels of ERK5 mRNA and p-ERK5 were decreased,and the degree of tissue injury and the apoptosis rate in hippocampal CA1 region increased (P＜0.05).Compared with the group 3.0%ISPOC,XMD8-92 independently diminished the expression of ERK5 mRNA and phosphorylation of ERK5 in the hippocampus,and enhanced tissue injury as well as apoptosis rate in the XMD+ISPOC group (P＜0.05).ConclusionsThe protective effect of Isoflurane posttreatment on hippocampal OGD injury in rats may be related to the upregulation of ERK5 mRNA and phosphorylation of ERK5.

Keywords:anesthetics;Isoflurane posttreatment;extracellular signal-regulated MAP kinases;brain ischemia;hippocampus

近年来急性缺血性脑损伤已成为全世界致残致死的主要原因之一，在临床诊疗过程中也存在中枢神经系统低灌注状态的高风险[1-2]，因此其在围术期中的管理一直受到麻醉医生的重视[3]。麻醉药物具有神经保护作用，并且其后处理减少缺血性损伤更具有临床意义[4]。由于异氟醚是一种具有适用范围广泛、刺激性小及苏醒快特点的常用麻醉药物，因此一直以来都是学者们在保护神经领域的重点研究对象，但是作用机制尚未完全明确[5]。许多研究表明，影响缺血损伤后脑神经细胞的存活因素包括一系列信号通路，其中，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族就是具有代表性的一个信号蛋白超家族，而最新发现该家族成员细胞外信号蛋白调节激酶5（extracellular signal-regulated protein kinase 5，ERK5）有较大C末端结构，而且具有抑制和核穿梭功能，可不干扰MAPK家族其他成员的功能，因此更适用于特定靶点的药物开发[6-7]。目前，关于ERK5在异氟醚神经保护中的作用尚未见报道，因此，本研究拟利用经典的大鼠海马脑片缺氧无糖损伤（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型，探讨ERK5在异氟醚神经保护中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雄性SD大鼠体重50～100 g（新疆石河子大学生理教研室动物实验中心），异氟醚（批号：64140902，山东省临沂鲁南制药集团），ERK5抑制剂XMD8-92（美国Selleck Chemicals公司），二甲基亚砜（DMSO）（批号：302A0324，美国Sigma Aldrich公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠海马脑片的复制使用10%水合氯醛（0.4 g/100 g）经腹腔注射将大鼠麻醉，达到一定麻醉深度后，迅速斩首将其安乐死，取脑组织，置于0～4℃预充95%氧气O2～5%二氧化碳CO2混合气的含糖人工脑脊液（ACSF，mmol/L：NaCl 124，KCl 3.3，NaHCO325.7；NaH2PO41.24，MgSO42.4，CaCl22.4，Glu 10，pH 7.35～7.45）中，在冰台上快速剥离出完整的海马组织。使用NVSL振动切片机（美国Campden Instruments公司）在距海马长轴两端10 mm处矢状面切片，厚度为400 μm，然后将海马脑片移至设定温度为34℃装有含糖ACSF的灌流槽中，并向其内浸润式通入95%O2～5%CO2混合气体孵育90 min，以修复制备过程中的损伤。随后可将部分脑片移入37℃含糖ACSF的灌流槽中，并向其内浸润式通入95%O2～5%CO2混合气体孵育30 min，作为正常对照组。

1.2.2 实验分组将脑片随机进行不同的分组处理，包括：正常对照组（Con组）、缺氧无糖损伤组（OGD组）、异氟醚后处理组（ISPOC组）、二甲基亚砜组（DMSO组）、ERK5抑制剂XMD8-92（XMD组）、ERK5抑制剂+3.0%异氟醚后处理组（XMD+ISPOC组）。其中，异氟醚后处理组分为3个浓度亚组（1.5%ISPOC组、3.0%ISPOC组和4.5%ISPOC组）。

1.2.3 缺氧无糖损伤模型的复制海马脑片在90min修复后，改用37℃的无糖人工脑脊液（glu-free ACSF，mmol/L：NaCl 124，KCl 3.3，NaHCO325.7，NaH2PO41.24，MgSO42.4，CaCl22.4，蔗糖 10，pH 7.35～7.45）并通入95%氮气N2～5%CO2混合气体孵育14 min，然后再使用37℃含糖的ACSF并通入95%O2～5%CO2混合气体孵育30 min，即复糖复氧。

1.2.4 脑片的异氟醚后处理在对脑片进行异氟醚后处理前，预先准备好等量的含有异氟醚的无氧无糖的ACSF和含有异氟醚的有氧含糖ACSF，配制方法如下：将预先加湿加热的95%N2～5%CO2混合气连接异氟醚挥发罐（德国Drager公司）的进气端，出气端通入无糖ACSF中平衡20 min，并将异氟醚挥发罐连接麻醉气体监测仪（德国Drager公司）测定通入ACSF中的异氟醚浓度，参照本课题组前期科研成果[8]，选取1.5%、3.0%和4.5%3个异氟醚浓度梯度；再采用同样的方法配制含有相应浓度异氟醚的有氧含糖ACSF。然后用95%N2～5%CO2平衡后的含异氟醚的无糖ACSF，于OGD结束前5 min灌注脑片。在OGD结束时，改用95%O2～5%CO2平衡后的含异氟醚的含糖ACSF继续灌注5 min，然后复氧复糖25 min，整个过程中异氟醚后处理10 min，复氧复糖30 min。

1.2.5 脑片的抑制剂处理将脑片用ERK5抑制剂XMD8-92（10μmol/L）在OGD前另外预孵育10min，然后OGD处理14 min，复氧灌流30 min；XMD8-92是通过特异性抑制BMK1/ERK5信号通路，从而化学阻断ERK5活化组。（XMD+ISPOC）组将使用抑制剂XMD8-92与异氟醚后处理联合同时进行。DMSO组将脑片在34℃的ACSF中孵育80 min时，将XMD8-92的溶剂DMSO加入到ACSF中孵育10 min，然后复氧复糖30 min。

1.2.6 脑片损伤程度的测定脑片复氧灌流后，避光下进行操作，用2%2，3，5-氯化三苯四唑（TTC）（批号：204H032，北京索莱宝科技公司）在35℃下染色30 min。随后用生理盐水冲洗，脑片表面水分用滤纸吸收，对脑片称重，以1 g∶20 ml的量，避光在4℃下对脑片中红色物质甲瓒用1∶1的乙醇和DMSO复合物抽提24 h，次日将抽提液加至96孔板（每孔100 μl），酶标仪测得在490 nm波长处各孔的吸光度（OD490值）。各组脑片的TTC染色下降百分率即为组织损伤百分率，按如下方法计算：（1-OD490实验组/OD490对照组）×100%，将计算组织损伤百分率进行统计学分析（OD490值越小，说明TTC染色下降的越大，脑片损伤越严重）。

1.2.7 凋亡细胞数的测定复氧灌流后，每组随机取8～10张脑片，避光下进行操作，用碘化丙啶（PI）（批号：MKBP1360V，美国Sigma Aldrich公司）加入ACSF中（2 μl/ml），37℃下，避光灌流细胞核染色 60 min，并通入95%O2～5%CO2混合气体。然后用磷酸盐缓冲液冲洗，浸入4%多聚甲醛中固定10 min，甘油封片。用激光共聚焦显微镜（激发光波530 nm，发射光波620 nm，LSM510，德国Zeiss公司）观察各组CA1区PI染色凋亡细胞核呈红色荧光的强度变化，使用Aim-Image Examiner软件（德国Zeiss公司）测定荧光强度，进行统计学分析（即PI荧光强度越大，代表凋亡细胞越多）。

1.2.8 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time fluorescent polymerase chain reaction，qRTPCR）检测ERK5 mRNA的表达取冷冻保存于-80℃冰箱中的各组脑片（70±10）mg，在冰盒上用液氮研磨方式打破细胞，使用Brizol（杭州博日科技有限公司）从脑组织匀浆中提取总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。利用互补 DNA（complementary DNA，cDNA）第一链合成试剂盒（杭州博日科技有限公司）进行总RNA逆转录，逆转录仪（美国Bio-Rad公司）设定逆转录条件为：室温预变性10 min，45℃变性45 min，95℃退火5 min，冰浴5 min。本实验中使用的特异性序列引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。ERK5，正向引物：5'-CTT CCAACCTCCTGCTGAAC-3'；反向引物：5'-GTCCAG CCAGAGGGTCAGTA-3'。MACTB，正向引物：5'-TT CCTTCTTGGGTATGGAAT-3'；反向引物：5'-GAGCA ATGATCTTGATCTTC-3'。逆转录后获取 cDNA，SYBR GreenⅠreal time PCR试剂盒（杭州博日科技有限公司）配置反应液。ABI 7500（美国Applied Biosystems公司）进行荧光定量PCR过程，按如下条件进行：94℃热启动 2 min，95℃变性 15 s，60℃退火30 s，然后40个循环。通过每个循环增加的相对荧光测定扩增量，获得每个实验组的循环阈值（Ct值），按照 ΔCT=Ct目的基因-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，将计算出来的 2-ΔΔCt值进行统计学分析。

1.2.9 免疫印迹法（Western blot）测定ERK5和磷酸化ERK5的表达水平在冰盒上，取各组大鼠海马脑片，使用含有PMSF和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解缓冲液（武汉博士德生物工程有限公司）将剪碎的组织裂解、超声波充分裂解2 s，然后离心15 min（4℃，12000r/min），取上清液。抽取各组等量总蛋白50μg分别加入到10%SDS-聚乙烯酰胺凝胶的孔中进行电泳分离，并用预染蛋白质Marker（北京Solarbio公司）作为分子量标记。电泳结束后，将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美国Roche公司），使用5%脱脂奶粉或牛血清蛋白（BSA）室温封闭2 h后，4℃下孵育特异性一抗过夜，ERK5一抗（1∶1 000，美国Abcam公司），p-ERK5一抗（1∶1 000，美国 Cell Signaling公司）和 β-actin（1∶1 000，北京中山金桥生物技术公司）。二抗孵育浓度为1∶20000，室温孵育2h。暗室曝光：膜上均匀涂抹发光试剂，显影，定影，曝光胶片。采用凝胶成像系统拍照，Image J软件（Gel-pro analyzer，美国Media Cybernetics公司）测定条带灰度值，将目的蛋白的灰度值与β-actin的灰度值的比值进行统计学分析。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett'st检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠海马脑片的损伤程度

与Con组比较，OGD组、XMD组和（XMD+ISPOC）组吸光度（optical density，OD）值降低、脑片损伤程度升高（P＜0.05），DMSO组OD值、损伤程度差异无统计学意义（P＞0.05）；与OGD组比较，3.0%ISPOC组OD值升高、损伤程度降低（P＜0.05）；而与3.0%ISPOC 组比较，1.5%ISPOC 组、4.5%ISPOC组、XMD组及（XMD+ISPOC）组OD值降低、损伤程度升高（P＜0.05）。见表 1。

表1 各组大鼠海马脑片OD490值和损伤百分率的比较（±s）

表1 各组大鼠海马脑片OD490值和损伤百分率的比较（±s）

注：1）与 Con 组比较，P＜0.05；2）与 OGD 组比较，P＜0.05；3）与3.0%ISPOC组比较，P＜0.05

组别 OD490值 组织损伤百分率/%Con组 0.59±0.04 0.00 OGD组ISPOC组0.28±0.03 53.22±1.791）1.5%ISPOC 组 0.32±0.05 44.85±5.571）2）3）3.0%ISPOC 组 0.45±0.04 23.93±2.461）2）4.5%ISPOC 组 0.31±0.04 47.81±3.851）3）DMSO 组 0.56±0.04 4.55±2.12）3）XMD 组 0.18±0.03 70.03±3.521）2）3）XMD+ISPOC 组 0.21±0.03 63.68±2.81）2）3）F值 - 344.000 P值 - 0.000

2.2 各组大鼠海马脑片CA1区神经细胞的凋亡程度

PI染色后各组脑片显示，与Con组比较，OGD组、XMD组及（XMD+ISPOC）海马CA1区凋亡的细胞增多（P＜0.05），DMSO组细胞凋亡程度差异无统计学意义（P＞0.05）；与 OGD 组比较，1.5%ISPOC 组、3.0%ISPOC组及4.5%ISPOC组海马CA1区凋亡的细胞减少（P＜0.05）；而与 3.0%ISPOC组比较，1.5%ISPOC组和4.5%ISPOC组海马CA1区凋亡的细胞增多，XMD组和（XMD+ISPOC）组海马CA1区凋亡的细胞增多（P＜0.05）。以上各组海马脑片CA1区神经细胞凋亡程度比较的检测结果与各组脑片损伤程度比较的检测结果基本相一致。见表2。

表2 各组大鼠海马脑片CA1区神经细胞凋亡程度的比较（±s）

表2 各组大鼠海马脑片CA1区神经细胞凋亡程度的比较（±s）

注：1）与 Con 组比较，P＜0.05；2）与 OGD 组比较，P＜0.05；3）与3.0%ISPOC组比较，P＜0.05

组别 细胞凋亡程度Con组 15.18±6.53 OGD组ISPOC组99.1±17.771）1.5%ISPOC 组 37.11±6.011）2）3）3.0%ISPOC 组 23.87±8.972）4.5%ISPOC 组 45.12±8.421）2）3）DMSO 组 22.99±6.052）3）XMD 组 102.84±9.951）3）XMD+ISPOC 组 108.07±6.761）3）F值 173.11 P值 0.000

2.3 各组大鼠海马脑片ERK5 mRNA的表达

ERK5 mRNA在各组脑片中的表达水平为：Con组（1.00±0.00）、OGD 组（2.63±0.25）、1.5%ISPOC组（2.25±0.06）、3.0%ISPOC 组（5.53±0.22）、4.5%ISPOC 组（1.24±0.25）、DMSO 组（1.18±0.11）、XMD组（0.16±0.04）及（XMD+ISPOC）组（0.27±0.02），以上各组表达差异有统计学意义（F=379.05，P=0.000）。与Con组比较，OGD组、1.5%ISPOC组及3.0%IS POC组ERK5 mRNA表达上调（P＜0.05），XMD组和（XMD+ISPOC）组 ERK5 mRNA表达下调（P＜0.05），DMSO组ERK5 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与OGD组比较，3.0%ISPOC组ERK5 mRNA表达上调 （P＜0.05），4.5%ISPOC 组、XMD 组和（XMD+ISPOC）组 ERK5 mRNA 表达下调（P＜0.05）；与3.0%ISPOC组比较，1.5%ISPOC组、4.5%ISPOC组、XMD组及（XMD+ISPOC）组 ERK5 mRNA表达下调（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠海马脑片ERK5信号蛋白的表达

Con组、OGD组、1.5%ISPOC组、3.0%ISPOC组及4.5%ISPOC组海马脑片p-ERK5蛋白的表达差异有统计学意义（F=94.07，P=0.000）。与Con组比较，OGD组、1.5%ISPOC组、3.0%ISPOC组及4.5%ISPOC组ERK5磷酸化蛋白水平升高（P＜0.05）；与OGD组比较，3.0%ISPOC组ERK5磷酸化蛋白水平升高（P＜0.05）；与 3.0%ISPOC 组比较，1.5%ISPOC组和4.5%ISPOC组ERK5磷酸化蛋白水平降低（P＜0.05）（见附图 A）。Con组、OGD 组、3.0%ISPOC 组、DMSO组、XMD组及（XMD+ISPOC）组海马脑片p-ERK5蛋白的表达差异有统计学意义（F=174.08，P=0.000）。与Con组比较，DMSO组ERK5磷酸化蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），单纯使用ERK5抑制剂XMD8-92后，ERK5磷酸化蛋白表达水平降低，XMD8-92与3.0%异氟醚联合处理后，ERK5磷酸化蛋白表达水平也降低（P＜0.05）（见附图B）。以上各组中磷酸化的ERK5表达结果与ERK5 mRNA的表达结果相一致。

附图 各组大鼠海马脑片p-ERK5蛋白的表达

3 讨论

研究表明，异氟醚诱导Ras-Raf-MEK-ERK通路磷酸化激活，减少神经元坏死，从而提供神经保护作用[9]。MAPK信号通路中上调磷酸化的ERK1/2和抑制磷酸化的JNK、p38能够对抗缺血诱导的细胞凋亡，起到神经保护作用[10-11]。而ERK5是MAPK家族的新成员，在海马CA1区，缺血预处理通过增加活化的p-Bad和14-3-3蛋白结合，使ERK5上调逆转活化的c-JNK下调，以及c-fos上调[12]。活化的ERK5能促进神经营养因子（BDNF）表达，从而修复缺血区域损伤的组织[13]。异氟醚能够上调神经保护蛋白Bcl-2和脑源性神经营养因子（BDNF），从而增强神经元存活[9]。有研究表明，ERK5可通过与KLF4通路级联诱导略高水平的H2O2活性氧预处理和神经生长因子（NGF），来减少原代海马神经元死亡[14]。

本研究结果显示，与Con组比较，OGD组海马脑片损伤程度升高、海马脑片CA1区凋亡细胞明显增多，提示大鼠海马脑片缺氧无糖损伤模型复制成功。与OGD组比较，1.5%ISPOC组和3.0%ISPOC组损伤程度降低，海马CA1区神经细胞凋亡减少，说明1.5%和3.0%浓度的异氟醚后处理对大鼠海马脑片OGD损伤起到保护作用；且3.0%ISPOC组ERK5 mRNA和p-ERK5的表达升高，而XMD8-92阻断3.0%ISPOC组海马组织内ERK5 mRNA和p-ERK5表达后，脑片损伤程度升高、海马CA1区凋亡细胞增多，说明异氟醚后处理对大鼠海马脑片OGD损伤的保护作用可能与ERK5 mRNA和p-ERK5的表达上调有关；4.5%浓度的异氟醚后处理并未起到保护作用，且ERK5 mRNA降低。与3.0%ISPOC组比较，1.5%ISPOC组和4.5%ISPOC组损伤程度高，海马CA1区神经细胞凋亡多，ERK5 mRNA和p-ERK5的表达低，说明一定浓度的异氟醚后处理可通过上调ERK5 mRNA和p-ERK5来减轻大鼠海马脑片OGD损伤，但是其浓度范围的掌握还应由更多实验证实和精准化。在本研究中观察3.0%ISPOC组神经保护作用最强，所以选择3.0%浓度异氟醚来进一步完成ERK5抑制剂联合异氟醚后处理组，即XMD+ISPOC组。使用DMSO作为ERK5抑制剂XMD8-92的溶剂，与Con组比较，DMSO组损伤程度和凋亡程度无差异，可排除对实验结果的影响；XMD组脑片损伤程度升高、海马CA1区神经细胞凋亡增多，ERK5 mRNA表达低，可见XMD8-92为强效的选择性的BMK1/ERK5抑制剂阻断ERK5信号通路后，脑片表现出易受损的状态。然而OGD处理后，大鼠海马区ERK5 mRNA和p-ERK5表达升高，可能与刺激机体自身保护反应有关，且有研究证实海马区的ERK5在大鼠缺血后迅速被激活[15]。

综上所述，一定浓度的异氟醚后处理大鼠海马脑片对抗OGD损伤的保护性机制可能与上调ERK5 mRNA和ERK5磷酸化水平有关。在围术期管理中，异氟醚介导的ERK5信号蛋白作为一种可能干预和防治缺血性脑损伤的目标靶点，随着研究和认识的不断深入，期望探索出它与其他通路在信号交互对话关系中扮演的角色，以及明确其在脑保护过程中的独特作用。

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Involvement of ERK5 in Isoflurane posttreatment-mediated protective effect on hippocampal oxygen-glucose deprivation injury in rats*

Di Cui1,Sheng Wang1,Ming-yue Ge1,Qin Wang1,Jiang-wen Yin1,Zhi-gang Dai1,Jun-qiang Si2
(1.Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832008,China;2.Department of Physiology,Medical College of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

R332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.001

1005-8982（2017）21-0001-06

2017-02-04

国家自然科学基金（No：81360203）

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