鸡源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

2017-10-11金福源朱国良江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所盛泽分所215200

中国畜禽种业 2017年7期

关键词：阿莫西林硫酸菌落

金福源朱国良（江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所盛泽分所 215200）

姚小兵陈永中李明观徐国东（江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所黎里分所 215200）

夏晓潮（广东省茂名市林业有害生物防治检疫管理办公室 525000）

鸡源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

金福源朱国良（江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所盛泽分所 215200）

姚小兵陈永中李明观徐国东（江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所黎里分所 215200）

夏晓潮（广东省茂名市林业有害生物防治检疫管理办公室 525000）

鸡大肠杆菌病是鸡感染致病性大肠杆菌后所引发的局部或者全身性败血症症状的疾病，临床菌株易对抗生素药物产生耐药性，实验数据表明，除头孢喹肟和硫酸粘菌素外，大多数临床分离株都对所选药物产生一定耐药；药敏试验表明，复方类抗生素相比单方抗生素对大肠杆菌病的治疗效果要明显；临床上遇到本病时建议在成本可控的范围内采用复方类抗生素或联合用药的方案进行治疗。

鸡；大肠杆菌；药敏试验；耐药性；分析

大肠杆菌为革兰氏染色呈阴性、中等大小的杆菌，需氧或微厌氧，在普通营养琼脂培养基上生长良好，在麦康凯琼脂培养基上可长成红色菌落，在伊红美蓝琼脂培养基上形成黑色带金属光泽的菌落。目前针对大肠杆菌病的防治措施是使用抗菌药物。由于抗生素大量使用以及耐药菌株的不断增加，大肠杆菌感染的趋势不但没有下降反而有所上升，给广大养殖户带来较大损失。笔者通过对全国规模化养殖场的疑似大肠杆菌病的发病鸡进行菌株分离鉴定，经药敏试验筛选出对大肠杆菌敏感的药物供大家选择，并就鸡源大肠杆菌的耐药情况给大家作一下交流。

1 本病流行特点及防治现状

鸡大肠杆菌病是临床严重危害养鸡业的细菌病之一，可导致鸡急性败血症、气囊炎、关节滑膜炎、全眼球炎、输卵管炎、腹膜炎、脐炎和肿头肿脸综合征等病症，尤其以蛋鸡和雏鸡发病更为严重。鸡感染后，一般不单独发病，往往继发于新城疫、马立克氏病、传染性支气管炎等病毒性疾病。本病发病率较高。在鸡群中可达11～69%，死亡率为3.2～72.9%，给养殖户带来较大的经济损失。

上世纪50年代禽致病性大肠杆菌几乎没有耐药性，60年代的分离株对链霉素、四环素产生耐药性，70年代对氨苄西林，氯霉素，磺胺甲基异恶唑等产生耐药性，80年代至90年代对阿莫西林、庆大霉素、卡那霉素、萘啶酸、头孢噻吩等产生耐药性。随着时间推移，大肠杆菌的耐药率大幅度上升，多重耐药菌株剧增，耐药谱增宽。

2 临床菌株的分离以及药敏试验

对来自全国各地区的疑似鸡大肠杆菌病的病例进行临床诊断，并无菌采集典型患鸡的心、肝、脾、十二指肠等病料进行分离鉴定和药敏试验，具体过程如下。

2.1 分离培养

取病料无菌操作，分别画线接种于血平板、伊红美蓝和麦康凯培养基上，置于37℃恒温培养箱培养16～24h，观察单个菌落的生长情况。

2.2 进一步分离纯化

挑取单个菌落接种至伊红美蓝和麦康凯培养基上进一步分离纯化，37℃恒温培养箱培养16～24h后观察结果。

2.3 涂片染色镜检

取分离纯化后的单个菌落进行涂片，革兰氏染色，在油镜下观察细菌的形态及染色特性。

2.4 菌液配置

取分离纯化后的单个菌落，无菌接种于2ml的营养肉汤培养基中37℃震荡培养16h得到菌液。

2.5 药敏试验

按K2B纸片扩散法将被检细菌无菌接种于普通琼脂平板上，间隔一定距离，然后用无菌镊子将药敏纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全紧贴。避免出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴4片。贴完纸片的平皿静置15min后再置于37℃温箱中培养24h，观察并记录抑菌圈的直径，结果判断依据《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准（第4版）》进行。

3 临床菌株的鉴定及耐药判定

3.1 菌落的形态及培养特征

在麦康凯和伊红美蓝培养基上在分离出呈圆形、边缘整齐、隆起、呈紫黑色并带有金属光泽的菌落，在麦康凯培养基上形成中等大小、表面光滑湿润的红色菌落，符合大肠杆菌的菌落特征。

3.2 镜检特征

取单个菌落，涂片，经革兰氏法染色，普通光学显微镜下观察，可见视野中的菌落均为两端钝圆，多数散在排列的革兰氏阴性杆菌。

3.3 药敏判定标准

将符合上述特征的菌株收集并进行药敏试验，依据抑菌圈直径的大小来判定药敏结果，敏感度根据表1来进行判断。

表1 药敏试验敏感性判定标准

4 结果及分析

4.1 单方药物的药敏结果及分析

本次试验分别对江苏、广东、北京、河南、河北等17个省市地区的130株大肠杆菌阳性菌株，选取市场上常见的治疗大肠杆菌的抗生素进行药敏试验，结果如表2所示。其中，临床分离的130株大肠杆菌，对阿莫西林、氨苄西林、林可霉素和氟苯尼考的耐药率都达到了100%，头孢喹肟对大肠杆菌最敏感，高敏菌株比例达100%，这可能与头孢喹肟为四代头孢类药物，上市时间短且价格昂贵造成普及率不高有关；其次为硫酸粘菌素，硫酸黏菌素对敏感菌的细胞膜具有较强的吸附作用，使细胞膜的表面张力降低，通透性增加，细胞膜破裂，菌体内物质外漏，导致细菌死亡；大观霉素不具有高敏作用，中敏率为63.8%，耐药率为36.2%。因此，从价格和药物敏感性来讲，单方药物治疗大肠杆菌病时，可优先选用硫酸粘菌素。

表2 单方药物药敏试验结果

4.2 复方药物的药敏结果及分析

复方药物通常指含有本身无抗菌活性但可增加主药敏感性的活性成分，如舒巴坦本身无抗菌活性，但与内酰胺类抗生素联用后药效增强几倍甚至几十倍。复方药物的药敏试验结果如表3所示，可以看出，阿莫西林与克拉维酸合用后可使大肠杆菌对阿莫西林的耐受性从100%降低到6.9%，头孢噻呋与舒巴坦合用可使大肠杆菌对药物的耐受性从83.3%降低到30%，头孢哌酮与他唑巴坦合用可使大肠杆菌对药物的耐受性从63.3%降低到15%，氨苄西林与舒巴坦合用可使大肠杆菌对药物的耐受性从100%降低到26.9%。阿莫西林西林克拉维酸合用对大肠杆菌的效果最好，头孢噻呋舒巴坦合用，以及头孢哌酮他唑巴坦合用效果也理想，但考虑到头孢类产品价格较贵，宜首选阿莫西林克拉维酸。氨苄西林与舒巴坦与合用后效果不如其他3种方案，原因可能是有些大肠杆菌临床菌株对其敏感性并未完全恢复，同时也表明鸡大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制可能不止一种。

表3 复方药物药敏试验结果

4.3 联合用药对大肠杆菌临床菌株的敏感性分析

两种或两种以上药物同时使用，不仅可以增加抗生素对大肠杆菌的敏感性，还可以降低抗生素的用药量。本试验将阿莫西林与硫酸粘菌素、林可霉素与大观霉素，氟苯尼考与多西环素，硫酸粘菌素与恩诺沙星等几种抗生素两两联合用药后，对大肠杆菌临床菌株产生明显的抑制作用，结果如表4所示，可以看出阿莫西林与硫酸粘菌素、林可霉素和大观霉素、氟苯尼考与多西环素、硫酸粘菌素与恩诺沙星合用以后，比各个药物单用效果要好，联用以后呈协同作用，尤其以硫酸粘菌素和恩诺沙星合用效果最佳，比各个药物单用效果增强20多倍，虽然硫酸粘菌素单用时效果也很好，但是其对肾脏和神经系统有一定副作用，因此，将硫酸粘菌素和其他抗生素联合用药，不仅可以增强疗效，还可以减轻副作用，降低用药成本。