膝关节骨关节炎患者血浆β-catenin基因rs1880481位点多态性变化及意义

陶瑞，杨相彩，范欣，邓紫玉,张桂前，高玉红，孙鹥

(1云南省第一人民医院，昆明650032；2昆明理工大学附属昆华医院)

·临床研究·

膝关节骨关节炎患者血浆β-catenin基因rs1880481位点多态性变化及意义

陶瑞1,2，杨相彩1,2，范欣1,2，邓紫玉1,张桂前1,2，高玉红1,2，孙鹥1,2

(1云南省第一人民医院，昆明650032；2昆明理工大学附属昆华医院)

目的探讨β-连环蛋白(β-catenin)基因rs1880481位点多态性与膝关节骨关节炎(OA)发病的关系。方法选择膝关节OA患者58例作为观察组(男18例、女40例)，同期体检健康者24例作为对照组(男11例、女13例)。采用一代测序的方法检测两组血浆β-catenin基因rs1880481位点基因型，计算基因型频率及等位基因频率，并分析其与性别的关系。结果观察组β-catenin基因rs1880481位点AA、CC基因型频率均低于对照组，AC基因型频率高于对照组(P均<0.05)；观察组男、女性患者β-catenin基因rs1880481位点AA、CC基因型频率均低于对照组同性别受试者，AC基因型频率高于对照组同性别受试者(P均<0.05)。观察组及其女性患者β-catenin基因rs1880481位点A、C等位基因频率与对照组及其女性受试者比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。观察组男性患者β-catenin基因rs1880481位点A等位基因频率高于对照组男性受试者，C等位基因频率低于对照组男性受试者(P均<0.05)。结论血浆β-catenin基因rs1880481位点AC基因型可能促进膝关节OA的发生，且AC基因型中的A等位基因频率升高可能与男性膝关节OA的发生有关。

骨关节炎；膝关节；β-连环蛋白；rs1880481位点；基因多态性；发病风险

骨关节炎(OA)是一种慢性、退行性关节疾病，可累及关节内各个结构，包括关节软骨、骨及滑膜等[1,2]。β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt信号通路中的一个重要传递因子，其在细胞内的表达水平决定了Wnt信号通路的开放或关闭：当细胞内β-catenin表达降低时，Wnt信号通路关闭，反之则Wnt信号通路开启[3,4]。研究表明，Wnt信号通路在软骨、骨生物力学和骨骼发育中发挥重要作用[5]，其信号通路相关因子β-catenin发生点突变可导致骨量异常，与多种骨科疾病的发生发展有关[6]。本研究观察了OA患者β-catenin基因7号内含子rs1880481位点多态性变化，旨在为深入研究OA的发病机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年11月～2015年8月云南省第一人民医院收治的膝关节OA患者58例作为观察组，男18例、女40例，年龄41～79(62.50±10.19)岁，均符合美国风湿病学会修订的骨关节炎诊断标准[1]。排除既往有关节外伤、手术史者，合并类风湿关节炎、关节结核者，合并严重感染及心、肝、肾等系统性疾病者。选择同期体检健康者24例作为对照组，男11例、女13例，年龄40～73(60.21±10.61)岁，无关节炎家族病史。本研究通过医院伦理委员会审核，患者及其家属均知情同意。

1.2 血浆β-catenin基因rs1880481位点多态性检测 抽取两组空腹肘静脉血2 mL，2%EDTA抗凝，参照核酸DNA提取试剂盒步骤提取基因组DNA。紫外分光光度计检测OD260/280、OD260/230判定DNA 纯度及浓度合格，-20 ℃保存。PCR扩增位于β-catenin基因第7内含子区域rs1880481位点及其侧翼区。引物序列[7]：上游引物：5′-TGGGACTGGAAGCTTAGGAA-3′，下游引物：5′-TCCCCTTTTCAAGGAGACCT-3′。PCR反应体系30 μL：提取的DNA 模板2 μL，2×Taq Master Mix 15 μL，上、下游引物各0.7 μL(10 pmol)，用超纯水补足到30 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性8 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物3 μL加入凝胶孔内，2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA扩增效果，紫外分光光度计检测PCR是否扩增出目的片段，预期目的片段扩增长度为304 bp。将PCR扩增产物采用ABI3730XL全自动DNA测序仪进行一代测序(Sanger测序)，通过双向测序确认基因型，计算基因型频率及等位基因频率。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。两组基因型频率及等位基因频率比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR产物电泳结果 目的片段条带清晰且比较单一，没有其他杂带。目的片段长度为304 bp，电泳图可见扩增目的条带在300～400 bp，说明PCR反应特异性较强。

2.2 两组β-catenin基因rs1880481位点基因型及等位基因频率比较 见表1、2。

表1 两组β-catenin基因rs1880481位点基因型频率比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

表2 两组β-catenin基因rs1880481位点等位基因频率比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

OA病情进展到一定程度会影响到关节内所有组织，造成不可逆转损伤，最终使关节失去作用。研究表明，除年龄、激素、关节创伤和机械应激等传统的发病诱因外，炎症介质、基质成分均可与特定受体结合，通过传递信号进入细胞核，激活基质金属蛋白酶和炎性基因转录，从而引发关节炎症反应[8]。Min等[9]研究发现，卷曲相关蛋白(FRZB)基因R324G位点突变与OA的发生有关。Lories等[10]研究发现，髋关节OA患者FRZB基因R200W位点突变频率增加。Urano等[11]报道，LRP5基因Q89R位点突变可引起日本患有脊柱OA的绝经后女性骨赘形成评分明显降低。以上研究结果均表明，基因多态性在OA的发生、发展过程中具有重要作用。

Wnt信号通路在维持关节和骨组织的生态平衡过程中具有关键作用。活化的Wnt信号通路能激活体内外关节软骨、骨分解和合成代谢过程，对长骨生物力学特性和软骨外基质分解代谢具有重要的调控作用[12]。β-catenin是被CTNNB1基因编码的一种多功能蛋白，主要位于细胞膜上，少量游离存在于细胞质中。β-catenin作为Wnt信号通路的重要组分，在细胞质内积累后可进入细胞核，与Lef/Tcf 相互作用，进而调节许多相关基因的表达[13]。β-catenin的功能主要是参与细胞与细胞间的相互粘连，其通过介导上皮细胞钙粘连蛋白与α-连环蛋白，将细胞外黏附分子与细胞骨架相互连接，参与细胞的黏附、迁徙与转移等过程[14]。Dellaccio等[15]研究发现，Wnt-16与β-catenin在中重度OA损伤软骨中的表达均升高，且β-catenin在退变的软骨细胞内表达亦升高。既往研究发现，β-catenin过度表达会导致软骨基质降解，关节软骨破坏[16]，但是其基因多态性改变与OA发生、发展关系的研究报道比较少。内含子的获得或缺失会影响mRNA基因转录起始、前提编辑、出核及翻译、降解等多种代谢过程。基因多态性改变会显著影响mRNA 的二级结构，可能是基因多态性可以直接引起表型改变的重要原因。本研究结果显示，观察组及其男、女性患者β-catenin基因rs1880481位点AA、CC基因型比例均明显低于对照组及其同性受试者，AC基因型比例均明显高于对照组及其同性受试者。说明β-catenin基因rs1880481位点AC基因型可能会促进膝关节OA的发生，AA、CC纯合基因型可能对膝关节OA的发生有一定抑制作用。本研究观察组男性患者β-catenin基因rs1880481位点A等位基因频率明显高于对照组男性受试者，C等位基因频率明显低于对照组男性受试者；观察组及其女性患者β-catenin基因rs1880481位点A、C等位基因频率与对照组及其女性受试者比较差异均无统计学意义。说明β-catenin基因rs1880481位点AC基因型中的A等位基因频率升高可能是导致男性膝关节OA发生率升高的原因之一，其原因可能与AC杂合基因编码的蛋白发生改变，并参与OA发生有关。

综上所述，血浆β-catenin基因rs1880481位点AC基因型可能促进膝关节OA发生，且AC基因型中的A等位基因频率升高可能与男性膝关节OA的发生有关。

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云南省科技计划项目(2014FZ067)。

孙鹥(E-mail： huludeng@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.015

R684.3

B

1002-266X(2017)32-0051-03

2017-01-12)