几种常见化合物对槲皮素稳定性的影响

2017-09-29许广人陈志刚陈惠玉雷红宇苏建明

饲料博览 2017年9期

关键词：还原剂槲皮素柠檬酸

许广人，陈志刚，陈惠玉，雷红宇，苏建明

（湖南农业大学动物医学院，长沙410128）

几种常见化合物对槲皮素稳定性的影响

许广人，陈志刚*，陈惠玉，雷红宇，苏建明*

（湖南农业大学动物医学院，长沙410128）

槲皮素是一种多酚羟基化合物，具有抗炎、抗氧化、提高动物生产性能、改善动物肉品质等功能。为探究生产或加工过程中常见化合物对槲皮素稳定性的影响，选取了不同浓度的氧化还原剂、金属化合物、糖类、柠檬酸等物质处理槲皮素6 h和24 h，并观察几种不同浓度的常见化合物对槲皮素浓度的影响。结果表明，过氧化氢和亚硝酸钠呈时间和浓度依赖性地降低槲皮素浓度（P＜0.05）；钾离子、钙离子、钠离子、葡萄糖、蔗糖和柠檬酸不影响槲皮素浓度（P＞0.05）；镁离子与槲皮素作用6 h，对其浓度无显著影响（P＞0.05），而作用24 h时，高浓度的镁离子显著降低了槲皮素溶液浓度（P＜0.05）；铝离子和铜离子作用6 h和24 h均能显著地降低槲皮素浓度（P＜0.05）。表明氧化剂、还原剂、镁离子、铜离子和铝离子会影响槲皮素稳定性，而钾离子、钙离子、钠离子、葡萄糖、蔗糖和柠檬酸不会影响槲皮素稳定性。

槲皮素；稳定性；化合物；质量控制

Abstract:Quercetin is a polyphenol hydroxy compound,which has the functions of antiinflammation,antioxidation,improving animal production performance and improving meat quality of animals.For investigating the effect of common compounds in the course of production or processing on quercetin stability,different concentrations of redox agent,metallic compounds,sugar,citric acid were selected to co-treat with quercetin for 6 h and 24 h,and the effect of several different concentrations of compounds on quercetin content were observed.The results showed that hydrogen peroxide and sodium nitrite decreased the concentrations of quercetin in a time and concentration dependent manner(P＜0.05).Potassium ions,calcium ions,sodium ions,glucose,sucrose and citric acid did not affect quercetin concentrations.The magnesian ion had no significant influence on quercetin concentrations at 6 h(P＞0.05),but significantly decreased the concentrations of quercetin at 24 h(P＜0.05).The concentrations of quercetin were markedly decreased in the presence of aluminum ion and copper ion at 6 h and 24 h(P＜0.05).It indicated that oxidant,reducing agent,magnesium ion,copper ion and aluminum ion could affect the stability of quercetin,but potassium,calcium ion,sodiumion,glucose,sucrose and citric acid could not affect the stability of quercetin.

Key words:quercetin;stability;compound;quality control

槲皮素是一种多酚羟基化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。已有研究证明，槲皮素可以抗动物致病菌，提高免疫功能、抗氧化能力和提高生长性能，改善鸡蛋品质和动物肉品质等，是一种较为高效的天然饲料添加剂[1-6]。然而，槲皮素的稳定性研究可以为槲皮素合理剂型的研发和药理研究提供有力的证据支撑。但是，目前关于槲皮素稳定性的研究多限于单一的吸光度比较，缺乏平行试验数据的收集和合理的统计分析，没有在试验体系中槲皮素浓度用量的具体说明，并且探究影响槲皮素稳定性的化合物作用浓度和作用时间缺少梯度设置，特别是没有浓度范围的考察，不足以较为全面地评价有关化合物对槲皮素稳定性影响[7]。因此，试验选取了不同浓度的氧化还原剂、金属离子、糖类、柠檬酸等物质以不同时间处理槲皮素，以槲皮素浓度的变化值作为评价指标，从而探究几种常见化合物对槲皮素稳定性的影响，为槲皮素在生产、加工与储存过程中的质量控制和在体外细胞研究中的溶液配制和使用方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

槲皮素（BR，≥98%），槲皮素标准品，购于上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、过氧化氢（H2O2）、亚硫酸钠（NaNO2）、氯化钾（KCl）、无水氯化钙（CaCl2）、柠檬酸、葡萄糖、氯化钠（NaCl）、六水氯化镁（MgCl2）、蔗糖、五水合硫酸铜（CuSO4·5H2O）、六水氯化铝（AlCl3·6H2O），均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；试验用水为双蒸水。

1.2 仪器

AY220电子分析天平，SHIMADZU；1510全波长酶标仪，Thermo Fisher。

1.3 槲皮素标准品溶液和槲皮素待测品溶液配制

采用电子分析天平称取槲皮素标准品0.0 493 g，少量无水乙醇溶解，100 mL容量瓶定容后转至玻璃瓶中，4℃放置，配制得到493 μg·mL-1槲皮素标准品溶液。称量槲皮素样品0.0 515 g，无水乙醇搅拌溶解，100 mL容量瓶定容后转至玻璃瓶中，4℃保存，配制得到槲皮素样品溶液。

1.4 波长扫描

吸取槲皮素样品溶液500 μL，加入等体积无水乙醇，混匀，以此类推，逐一稀释3次。第3个稀释管中加入双蒸水500 μL，充分混匀。移取第3个稀释管溶液100 μL于已预铺100 μL的96孔板中，混匀。酶标仪在340～400 nm进行波长扫描。选择最高峰对应的波长作为槲皮素的测定波长。

1.5 槲皮素的测定标准曲线制作

在7个2 mL离心管中各加入无水乙醇500 μL，最后1管加入槲皮素标准品溶液500 μL，混匀。吸取500 μL于倒数第2管，混匀，从中吸取500 μL于倒数第3管，按此规律逐一操作至第倒数第6管，并弃去第6管500 μL。各管加入500 μL双蒸水，混匀。在96孔板上选取7个孔，各加双蒸水入100 μL。从7个离心管中吸取100 μL溶液对应加入96孔板上的7个孔中，以第1个孔作为调零孔，测定吸光度。以槲皮素标准品溶液浓度X（μg·mL-1）为横轴，吸光度Y为纵轴，制作标准曲线。

1.6 槲皮素浓度测定

吸取100 μL槲皮素样品溶液至已预加100 μL双蒸水的96孔板中，混匀，测定吸光度，平行4次。将测得的吸光度代入标准曲线的方程，计算槲皮素溶液浓度。

1.7 不同浓度氧化剂和还原剂对槲皮素浓度的影响

在2 mL离心管中各加入槲皮素样品溶液500 μL，再加入不同浓度H2O2的水溶液500 μL，使H2O2的终浓度为0、0.004%、0.016%、0.063%、0.250%、1.000%（V/V），以不含槲皮素溶液的试验管作为调零管。NaNO2终浓度为0、0.016%、0.031%、0.063%、0.125%、0.250%、0.500%、1.000%（m/V），处理同于H2O2。作用6、24 h后，按测定方法计算槲皮素溶液浓度。计算公式：倍数=各组槲皮素浓度/对照组槲皮素浓度。

1.8 不同浓度金属化合物对槲皮素浓度的影响

在2 mL离心管中各加入槲皮素样品溶液500 μL，再加入不同浓度金属化合物（KCl、CaCl2、NaCl、MgCl2、AlCl3·6H2O、CuSO4·5H2O）的水溶液500 μL，使KCl的终浓度为0～0.125%（m/V），CaCl2终浓度为0～0.125%（m/V），NaCl终浓度为0～1.000%（m/V），MgCl2终浓度为0～1.000%（m/V），AlCl3·6H2O终浓度为0～1.000%（m/V），CuSO4·5H2O终浓度为0～0.063%（m/V），以不含槲皮素溶液的试验管作为调零管。分别作用6和24 h后，计算槲皮素溶液浓度。

1.9 不同浓度糖类对槲皮素浓度的影响

在2 mL离心管中各加入槲皮素样品溶液500 μL，再加入不同浓度葡萄糖和蔗糖的水溶液500 μL，使葡萄糖的终浓度为0～1.000%（m/V），蔗糖终浓度为0～1.000%（m/V），以不含槲皮素溶液的试验管作为调零管。分别作用6和24 h后，计算槲皮素溶液浓度。

1.10 不同浓度柠檬酸对槲皮素浓度的影响

在2 mL离心管中各加入槲皮素样品溶液500 μL，再加入不同浓度柠檬酸的水溶液500 μL，使柠檬酸的终浓度为0～0.031%（m/V），以与各试验管相比不含槲皮素溶液作为调零管。分别作用6和24 h后，计算槲皮素溶液浓度。

1.11 数据统计与分析

采用独立样本t检验分析差异性。数据以“平均值±标准差”表示，图中星号表示数据与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。

2 试验结果

2.1 最大吸收波长的确定与标准曲线的制作

在340～400 nm进行波长扫描，槲皮素样品溶液在370 nm处有最高峰，因此选择370 nm作为测定波长。在370 nm波长处测定的标准曲线如图1所示，线性方程为y=0.034 6x+0.034 1，R2=0.997 6。结果表明，槲皮素在0～61.63 μg·mL-1内具有较好的线性关系。

图1 槲皮素测定标准曲线

2.2 不同浓度氧化剂和还原剂对槲皮素浓度的影响

氧化剂H2O2对槲皮素浓度的影响见图2，H2O2在作用于槲皮素6 h时，从0.250%起开始降低槲皮素浓度，而作用24 h时，从0.016%时就使槲皮素的浓度发生了显著的降低（P＜0.05）。还原剂NaNO2对槲皮素浓度的影响见图3，NaNO2在6和24 h两个时间段使槲皮素浓度发生显著性变化的浓度与过氧化氢处理基本一致（P＜0.05）。表明氧化剂H2O2和还原剂NaNO2降低槲皮素浓度，呈现显著的浓度依赖与时间依赖关系。

图2 不同浓度H2O2对槲皮素浓度的影响

图3 不同浓度NaNO2对槲皮素浓度的影响

2.3 不同浓度金属化合物对槲皮素浓度的影响

KCl、CaCl2、NaCl对槲皮素浓度的影响分别见图4、5、6，KCl（0～0.125%）、CaCl2（0～0.125%）、NaCl（0～1.000%）作用于槲皮素6和24 h时，均未显著改变槲皮素浓度（P＞0.05），表明其不会改变槲皮素的稳定性。MgCl2对槲皮素浓度的影响见图7，0～1.000%的MgCl2对槲皮素作用6 h，对其浓度无显著影响，而作用24 h时，0.500%、1.000%的MgCl2显著降低了槲皮素的浓度（P＜0.05），表明随着作用时间的延长，MgCl2对槲皮素的稳定性影响越大。AlCl3·6H2O（0～1.000%）和CuSO4·5H2O（0～0.063%）对槲皮素浓度的影响分别见图8、9，无论是作用6还是24 h均显著降低了槲皮素的浓度，0.004%～1.000%的AlCl3·6H2O及0.008%～0.063%的CuSO4·5H2O在两个作用时段均使槲皮素的浓度下降＞50%（P＜0.05），且在加完AlCl3·6H2O或CuSO4·5H2O后均可见其混合液为黄色透明溶液。表明AlCl3·6H2O、CuSO4·5H2O对槲皮素的稳定性有显著影响。

图4 不同浓度KCl对槲皮素浓度的影响

图5 不同浓度CaCl2对槲皮素浓度的影响

图6 不同浓度NaCl对槲皮素浓度的影响

图7 不同浓度MgCl2对槲皮素浓度的影响

2.4 不同浓度糖类对槲皮素浓度的影响

不同浓度的葡萄糖、蔗糖对槲皮素浓度的影响分别见图10、11，作用不同时间后，槲皮素的浓度均无明显变化（P＞0.05），表明这两种糖类物质对槲皮素稳定性无影响。

图8 不同浓度AlCl3·6H2O对槲皮素浓度的影响

图9 不同浓度CuSO4·5H2O对槲皮素浓度的影响

图10不同浓度葡萄糖对槲皮素浓度的影响

图11不同浓度蔗糖对槲皮素浓度的影响

2.5 不同浓度柠檬酸对槲皮素浓度的影响

不同浓度柠檬酸对槲皮素浓度的影响见图12，0～0.031%的柠檬酸作用6和24 h后，对槲皮素的浓度无显著改变（P＞0.05），表明不影响其稳定性。

图12不同浓度柠檬酸对槲皮素浓度的影响

3 讨论

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜、水果和草本植物中。在340～400 nm对槲皮素样品溶液进行波长扫描，发现在370 nm处有最高峰，接近374 nm[8]。因此，选择370 nm作为测定波长。与前人关于槲皮素稳定性研究不同的是试验构建了测定标准曲线，以槲皮素浓度的变化来判断其稳定性；对几种化合物设置了不同作用浓度和作用时间；进行了平行试验，以t检验分析其是否对槲皮素稳定性有影响，而不是单纯地以一个吸光度的多少衡量其稳定性。

研究表明H2O2不影响槲皮素稳定性，但还原剂Na2SO3和Na2S2O3降低了槲皮素的测定吸光度[7]。郑丽等研究表明，0～2%的H2O2作用于黄秋葵黄酮30 min时，对黄秋葵黄酮稳定性无影响，但0.01%～0.05%的还原剂Na2SO3对其稳定性影响较大[9]。而试验发现氧化剂H2O2和还原剂NaNO2在作用槲皮素6 h和24 h均会影响槲皮素的稳定性。氧化剂作用后结果不一致的原因可能是H2O2作用时间太短和作用浓度太低。槲皮素溶液在与高浓度氧化剂和还原剂接触时易被氧化和还原，随着作用时间延长氧化还原反应加剧。因此在槲皮素的生产、加工或储存过程中，应避免与高浓度强氧化剂和强还原剂接触。金属离子以化合物的形式或多或少地存在于饲料中，通过摄食途径补充畜禽进行生命活动不可或缺的金属离子。研究发现钾离子、钙离子和钠离子和低浓度镁离子不影响槲皮素的稳定性，而高浓度的镁离子长时间与槲皮素接触，对其稳定性的影响较大。铝离子和铜离子极大地降低了槲皮素的浓度。其原因可能是铝离子和铜离子易与槲皮素的邻二酚羟基发生络合反应，损失槲皮素，生成了新的物质——槲皮素-金属络合物。因此在生产或使用过程中槲皮素以溶液形式存在时应避免与铝离子和铜离子接触，与镁离子不宜长时间接触。葡萄糖和蔗糖主要扮演甜味剂的角色，改善口感及风味，也可以补充能量。柠檬酸作为有机酸，常用作酸味剂，具有促进动物生长，提高幼畜的抗病能力、饲料转化率，缩短饲喂周期等作用。试验表明葡萄糖和蔗糖等碳水化合物及柠檬酸与槲皮素溶液作用不改变槲皮素浓度。试验结果表明氧化剂、还原剂、镁离子、铜离子和铝离子会影响槲皮素稳定性，而钾离子、钙离子、钠离子、葡萄糖、蔗糖和柠檬酸不会改变槲皮素稳定性，该研究为槲皮素在生产、添加剂或兽药加工与储存过程中的质量控制和在体外细胞研究中的溶液配制和使用方面提供了参考。

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[2]杨家新,李垚,韩春艳,等.槲皮素对AA肉鸡免疫功能的作用[A].中国畜牧兽医学会动物营养学分会.中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十二次动物营养学术研讨会论文集[C].中国畜牧兽医学会动物营养学分会,2016.

[3]孙丹彤.槲皮素对蛋鸡生产性能、体内和体外抗氧化指标的影响[D].哈尔滨∶东北农业大学,2015.

[4]邹轶,向全航,彭健.止痢草油和槲皮素对育肥猪生长性能和运输应激的影响[A].中国畜牧兽医学会动物营养学分会.中国畜牧兽医学会动物营养学分会第七届中国饲料营养学术研讨会论文集[C]中国畜牧兽医学会动物营养学分会,2014.

[5]刘红南,滕楠,李垚,等.饲粮添加槲皮素对蛋鸡蛋品质和蛋组分的影响[J].动物营养学报,2014,26（8）∶2 246-2 252.

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[9]郑丽,李和生,金洋,等.黄秋葵黄酮的稳定性研究[J].中国蔬菜,2017（8）∶67-71.

Effect of Several Common Compounds on Stability of Quercetin

XU Guangren,CHEN Zhigang*,CHEN Huiyu,LEI Hongyu,SU Jianming*

（College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China）