高效液相色谱法同时测定山豆根中4种生物碱的含量与聚类分析

程 钱 ，邹秦文 ，汪建芬 ，韩红园 ，刘雯雪 ，徐柯心 ，康 帅 ，马志强 ，林瑞超

（1.北京中医药大学中药品质评价北京市重点实验室，北京 100102； 2.北京联馨药业有限公司，北京102600； 3.中国食品药品检定研究院，北京 100050）

高效液相色谱法同时测定山豆根中4种生物碱的含量与聚类分析

程 钱1，邹秦文2，汪建芬1，韩红园1，刘雯雪1，徐柯心1，康 帅3，马志强1，林瑞超1

（1.北京中医药大学中药品质评价北京市重点实验室，北京 100102； 2.北京联馨药业有限公司，北京102600； 3.中国食品药品检定研究院，北京 100050）

目的建立同时测定山豆根中苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱的高效液相色谱法。方法 色谱柱采用Zorbax SB C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 m），流动相为甲醇（A） -0.2%磷酸（用三乙胺调 pH 5.0，B）梯度洗脱，流速 1 mL ／min，检测波长 215 nm，柱温 30 ℃。结果 苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱质量浓度分别在 31.40 ～2 910.47 g／mL，28.70 ～164.53 g／mL，50.16 ～813.43 g／mL，71.43～4 300.00 g／mL范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r 0.999 0)，平均回收率为100.41% ～101.23%，RSD为1.82% ～2.16%（n＝6）。结论 该方法简单、准确，重复性良好。不同产地4种生物碱含量差异较大，道地产区有效成分含量相对较高。

高效液相色谱；山豆根；生物碱；含量测定；聚类分析

山豆根 Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis豆科植物越南槐 Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根茎[1]，又名广豆根、大山豆根、黄结、苦豆根、南豆根等，味苦、性寒，具有泻火解毒、消肿利咽、止痛杀虫的功效，用于治疗火毒蕴结、咽喉和齿龈肿痛口舌生疮等症。山豆根中主要含有生物碱类、黄酮类、三萜类成分[2]，其中主要活性成分为生物碱类。2015年版《中国药典（一部）》中对苦参碱和氧化苦参碱的总量规定不得低于0.7%。本研究中探讨了同时测定山豆根中4种生物碱含量的方法，方法简单、准确，重复性好，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；FW-200型药物粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；EYELA OSB-2100型旋转蒸发器（北京五洲东方科技发展有限公司）；分析天平（瑞士Mettler Toledo NewClassic MF）。

1.2 材料

山豆根分别采自广西、云南，经北京中医药大学中药鉴定系王晶娟副教授鉴定为山豆根 Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis，室温风干，阴干后粉碎过五号筛（80目筛）备用(见表 1)。苦参碱（批号为 PS0187-0010，纯度≥98.5% ），氧化苦参碱（批号为 PS0187-0020，纯度≥98.5% ），槐果碱（批号为 PS160701-02，纯度≥98%）、氧化槐果碱（批号为 PS160701-01，纯度≥98%）均购于成都普思生物科技有限公司。甲醇为色谱纯，氯仿、磷酸、三乙胺为分析纯，水为哇哈哈纯净水。

表1 山豆根产地信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Zorbax SB C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A） -0.2%磷酸（用三乙胺调 pH 至5.0，B），洗脱梯度，0→4 min时 A 2%→2.6%，4→34 min时 A 2.6%→2.7%，使用前用微孔滤膜过滤并进行超声脱气处理；检测波长：215 nm；流速：1 mL ／min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。色谱图见图 1，4种生物碱紫外光谱图见图2，通过相对保留时间和光图谱对样品中4种生物碱进行归属。

图1 高效液相色谱图

图2 紫外光谱图

2.2 溶液制备

对照品溶液：取苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱适量，精密称定，置5mL容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL约含苦参碱3 000.00 μg、槐果碱 660.00 μg、氧化槐果碱 1 000.00 μg、氧化苦参碱 625.00 μg 的混合溶液，即得。

供试品溶液：取山豆根粉末，精密称量3 g，置具塞锥形瓶中，加65%乙醇60 mL，同时加入盐酸调节pH＝0.5，超声 30 min（功率 50 W，频率 40 kHz），补足质量，过滤，连续提取3次，合并3次滤液，将滤液旋转蒸发至无醇浸膏，加入40 mL蒸馏水溶解浸膏，移至250 mL分液漏斗，再向分液漏斗中加入NaOH溶液调节pH 10.5，加40 mL氯仿，萃取，静置20 min，取氯仿层，萃取3次，合并3次氯仿溶液，将氯仿溶液置于旋转蒸发仪上浓缩得干燥物，最后用甲醇溶解，溶解物转移至10 mL容量瓶内，定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得[2]。

2.3 方法学考察

标准曲线绘制：分别取上述对照品溶液，用甲醇稀释成5个质量浓度，4种生物碱的质量浓度分别为：苦参碱31.400，486.700，854.000，1 756.000，2 910.465 μg／mL；槐果碱 28.696，70.541，100.023，120.111，164.526μg／mL；氧 化 槐 果 碱 50.163， 305.000， 406.666， 488.000，813.428μg／mL；氧化苦参碱 171.429，400.000，1200.00，2 200.000，4 300.00 μg ／mL。用 0.45 μm 微孔过滤后，分别按上述色谱条件进样5 μL，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标（Y，A）、质量浓度为横坐标（X，C）进行线性回归。结果见表2。

表2 4种成分的线性回归方程及线性范围（n＝5）

精密度试验：精密吸取1号供试品溶液5 μL，连续进样5次。结果苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱色谱峰面积的 RSD值分别为2.91%，1.87%，1.24%，1.18%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取1号供试品溶液，于0，2，4，6，8，10，12，24 h 时进样，分别测定。结果苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱峰面积结果的 RSD分别为1.77% ，1.33% ，1.18% ，2.53% （n ＝ 5），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：取1号供试品6份，按供试品溶液制备方法制备溶液，进行含量测定。结果苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱的平均含量为 0.20%，0.05% ，0.27% ，1.18% ， RSD 分别为 1.77% ，2.97% ，1.6%，2.20% （n ＝ 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已测定的同批次山豆根样品6份（1号），每份约 0.25 g，精密称取，分别加入对照品适量，依法制备供试品溶液，按照拟订色谱条件进行含量测定，计算4种成分的平均回收率及 RSD。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

精密称取13批山豆根各2份，每份3 g，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进行含量测定，进样量5 μL，利用外标法计算各生物碱含量。结果见表4。

表4 13批山豆根样品中4种成分的含量测定结果（n＝2）

2.5 聚类分析

聚类分析是一种对一个数据，即可以对变量（指标）进行分类（相当于对数据中的列进行分类），也可对观测值（事件、样品）进行分类（相当于对数据中的行进行分类）的统计学方法。聚类分析首先确定变量，再通过统计软件计算点与点之间的距离或者类与类之间的距离将不同的样本分为几类，并且生成相应的树状图，从而实现对样本的分类。

本试验中对13个产地山豆根中的 4种生物碱含量进行了统计学分析[3]，将13个产地进行了归类。采用SAS 8.2统计分析软件，以4种生物碱含量为变量，采用离差平方和法（ward法）对不同产地的山豆根药材进行聚类分析，结果见图3。结果表明，当阈值为2时，13个产地的山豆根被分为3组，S1（广西百色1）、S6（广西环江下南乡）、S2（广西百色 2）、S3（广西百色 3）为Ⅰ组，S4（广西金城江五圩镇）、S13（云南罗平）、S12（广西那坡）、S5（广西金城江九圩镇）为Ⅱ组，S7（广西环江水源）、S11（广西靖西）、S8（广西东兰县）、S9（云南 1）、S10（云南2）为Ⅲ组。

图3 13批山豆根药材聚类树状图

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法考察

曾考察水浴回流提取与超声提取两种方法，结果表明两者的测定结果无显著性差异，但超声提取更简单易行，故选用超声法提取。比较甲醇 -盐酸（调 pH为0.5）、65% 乙醇 - 盐酸（调 pH 为 0.5）、乙醇 - 盐酸（调pH为0.5）3种混合溶液的提取效率，结果乙醇-盐酸（pH 0.5）的提取效率较低，且甲醇 -盐酸（调 pH为0.5）和 65%乙醇 -盐酸（调 pH 为 0.5）的提取效率无显著性差异，但考虑甲醇毒性较大，因此选用65%乙醇-盐酸（调pH为0.5）混合溶液作为提取溶剂。同时，考察了超声时间（20，30，40 min）对提取效率的影响。最终选择以65%乙醇-盐酸（调pH为0.5）为提取溶剂，超声提取30 min为供试品制备方法。

3.2 色谱柱、流动相及检测波长选择

考察 Zorbax SB C18柱、Welch Ultimate XB-NH2柱对待测成分的分离效能，结果表明，使用Zorbax SB C18柱可获得平稳的基线，且各待测成分的峰形良好，故选用该色谱柱为分离柱。利用Waters公司的PDA检测器进行全波长扫描，发现4种成分于215 nm波长处有均有较大吸收，因此检测波长为215 nm。同时，考察了乙腈 - 甲酸（0.2% ）、甲醇 - 甲酸（0.2% ）、甲醇 - 磷酸（0.2% ）、甲醇 -0.2% 磷酸（用三乙胺调 pH 为 5.0），结果表明，使用甲酸于215 nm波长处基线严重漂移，因此最终选择甲醇-0.2%磷酸（用三乙胺调pH为5.0）。

3.3 测定结果分析

本研究中对不同产地的山豆根进行了含量测定，结果表明，除S8号产地（广西东兰县）的苦参碱和氧化苦参碱总量低于2015年版《中国药典（一部）》对于山豆根药材中苦参碱和氧化苦参碱的总含量要求(苦参碱和氧化苦参碱的总量≥0.7%)，其余12个产地的山豆根的苦参碱和氧化苦参碱的含量在0.78% ～1.62%之间，符合药典规定。造成S8号（广西东兰县）的含量低于规定这一结果的原因，可能是实验过程中的操作和测量误差导致的测定含量低于实际含量。13个产地的山豆根基本符合本中国药典的质量要求。苦参碱和氧化苦参碱总量大于1.00%的产地大部分为广西，与广西为山豆根的道地产区这一事实相符合，且苦参碱与氧苦参碱的含量呈“此消彼长”[4]。聚类分析结果表明，不同产地对山豆根生物碱的含量影响较大，不同分组的产地区分不明显，可能是由于产地数量有限的原因导致，提示应该增加样本的产地、批次以获取更为准确客观的研究结果。

3.4 不足之处

山豆根为有毒中药，生物碱部分既是其有效成分，又是其毒性成分[5-7]。本研究中通过探索建立了HPLC法同时测定4种生物碱含量的方法，并通过统计学方法对产地进行聚类分析，为山豆根药材的质量控制提供了参考，但同时针对山豆根毒性评价的研究相对较少，尤其是能用于高通量筛选的动物模型更为缺乏，关于其毒性的时-效关系、量-效关系还有待进一步研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：27.

[2]郭 智.基于UPLC-ESI-QTof的山豆根、苦参化学成分比较及柴胡不同提取方法柴胡皂苷 a、d变化的研究[D].北京:北京协和医学院中国医学科学院，2014.

[3]陆国寿，叶 勇，卢文杰，等.多叶越南槐中苦参碱与氧化苦参碱的分离鉴定及含量测定研究[J].广西医学，2014(8):1109-1112.

[4]田婷婷，马英华，解伟伟，等.LC-MS／MS同时测定蓝萼香菜中4种二萜类成分及其聚类分析[J].中国中药杂志，2016，41(2):250-256.

[5]韩馥蔓，王莉鑫，陈 影，等.HPLC同时测定山豆根中7种生物碱及 3种黄酮的含量[J].中国中药杂志，2016，41（24）：4628-4634.

[6]郑丽娜，孙 虎，谢元璋，等.山豆根化学成分与功效、毒性相互关系的研究进展[J].食品与药品，2011，13(3):205-209.

[7]丁佩兰.山豆根和苦参化学成分的比较研究[D].上海：复旦大学，2004.

Simultaneous Determination of Four Alkaloids in Radix et Rhizoma Sophorae Tonkinensis by HPLC and Cluster Analysis

Cheng Qian1,Zou Qinwen2,Wang Jianfen1,Han Hongyuan1,Liu Wenxue1,Xu Kexin1,Kang Shuai3,Ma Zhiqiang1,Lin Ruichao1
(1.Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,China 100102;2.Beijing Lianxin Pharmaceutical Co.,Ltd.,Beijing,China 102600; 3.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing,China 100050)

ObjectiveTo establish an HPLC method for simultaneous determination of matrin,oxymatrine,sophocarpine and oxysophocarpine in Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis.Methods The Agilent Zorbax SB C18column(150 mm × 4.6 mm,5 μm)was adopted with methanol(A)-0.2% phosphoric acid solution(B)(adjusted pH ＝ 5.0 by triethylamine)as mobile phase in gradient elution.The flow rate was 1 mL ／min and detection wavelength was 215 nm,the column temperature was 30 ℃.Results The linear ranges of matrin,oxymatrine,sophocarpine and oxysophocarpine were 31.40-2 910.47 μg ／mL,28.70-164.53 μg ／mL,50.16-813.43 μg ／mL,71.43-4 300.00 μg ／mL(r≥0.999 0),the average percentages of recovery were in the range of 100.41% to 101.23% with the RSD between 1.82% to 2.16%(n ＝ 6).Conclusion This method is simple,accurate and repeatable.The content of 4 alkaloids in different habitats is different,and the content of four alkaloids in geo-authentic habitats of Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis was relatively high.

HPLC;Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis;alkaloid;content determination;cluster analysis

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)17－0010－04

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.003

2015年中央公益性行业科研专项“中药饮片质量保障体系研究(一)”[201507002]。

程钱，硕士研究生在读，研究方向为中药检验与分析，（电子信箱）1398523251＠qq.com。

林瑞超，博士生导师，研究方向为中药品质评价研究，（电话）010-84738653（电子信箱）linrch307＠sina.com。

2017－05－09)