犬血涂片的制作、染色和应用

贺星亮 杨武红

犬血涂片的制作、染色和应用

贺星亮 杨武红

随着精密的自动化血细胞分析仪的开发与使用，大大提高了实验结果的精准性和重复性，提高了临床血液学检验的质量和效率，但同时又面临着一个新的问题：仪器对血液细胞形态和内部结构的识别存在着局限性和不足，甚至是误导，这就需要传统的血涂片镜检加以识别、确认，做出最终判断，这充分说明了人工细胞形态学检验不是血液细胞分析仪所全部能替代的。可以说自动化仪器与传统血涂片镜检是现代与传统的结合，它们之间相互弥补，缺一不可。

一、临床血涂片的作用和面临的问题

血涂片染色显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本方法，主要用于红细胞、白细胞、血小板形态等检查，还可以用于白细胞、血小板的数量评估。在临床应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。但我们也面临一些问题：

血图片制备不良，染色不佳，常使血细胞的形态学鉴别和诊断发生困难，甚至导致错误的结论。如果血膜过厚则使细胞重叠缩小，血膜太薄易导致细胞分布不匀，白细胞多集中于边缘。因此，制备厚薄适宜、头体尾分明、染色良好的血涂片，是血细胞形态学检查最基本的要求，必须以认真负责的态度注意操作过程中的每一个环节。

二、制作血涂片的血液样品

用作血涂片的血液样品从前肢静脉采血，自吸真空管是首选的采血器具，大多数血液学检验都选用EDTA作为抗凝剂，血液采集后应尽快制备血涂片，与EDTA接触时间长会导致中性粒细胞和血小板出现人为异常，红细胞与EDTA接触24小时后容易发生溶解。检查血小板和抗凝实验时，建议选用柠檬酸钠作为抗凝剂。用自吸真空管采血采血量必须达到其标注容量，以使血液/抗凝剂达到最佳比例，采集血液后颠倒管子数次，充分混匀。

三、血涂片的制备

（一）玻片的处理

新购进的玻片常带有游离碱质，必须用浓度约1mol/L HCl 浸泡24小时后，再用清水彻底冲洗，干燥后备用；用过的玻片将其放肥皂或洗衣粉中煮沸20min，用热水将肥皂和血膜等污物洗去，用自来水反复冲洗， 再用蒸馏水冲洗3～5次，必要时再置95% 酒精浸泡1h， 然后擦干或烘干备用。使用载玻片时，切勿用手触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油渍。

（二）血涂片的制备

1.可直接用非抗凝的静脉血或毛细血管血，也可以用经EDTA抗凝的血液制备。由于EDTA能阻止血小板聚集，显微镜下观察血小板形态时常采用，但EDTA抗凝血有时能引起红细胞皱缩和白细胞聚集，因此最好使用非抗凝血制备血涂片。

2.临床上用的普通手工推片法是取血标本1滴置载玻片的一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，通常推片与载玻片保持30～45度夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。一张好的血涂片，要求厚薄适宜、头体尾分明、边缘整齐、两侧应留有空隙，图片质量与血滴大小、推片与载玻片间夹角、推片速度、血细胞比容有关。

3.推片边缘要整齐、平滑，推片时， 血滴愈大，角度愈大， 推片速度愈快则血膜愈厚；反之血膜愈薄，血膜分布不匀主要是推片不齐用力不均，玻片不洁所致。血细胞比容高于正常时，血液粘度较高，保持较小的角度，可得满意结果；相反，血细胞比容低于正常时，血液较稀薄，则用较大角度。

（三）几种常用的血涂片的染色方法

1.瑞氏染色法：将自然干燥的血涂片置于水平支架上，滴瑞氏染液至覆盖血膜为止，染色 1～2 min，加等量磷酸盐缓冲液轻轻吹动，使之混匀，5 min 后用纯化水冲洗，自然干燥，镜检。

2.姬姆萨染色法：干燥的血涂片经甲醇固定后，直立于姬姆萨染液缸中，60 min 后取出镜检。

3.瑞-姬混合染色法：将自然干燥的血涂片置于水平支架上，滴瑞-姬混合染色液至覆盖血膜为止，染色 10 min，冲洗，镜检。

4.罗曼斯基染色法：取10ml的Ⅰ液用 50mlⅡ液稀释，染色10 min。

（四）常用染色法的特点

1.瑞氏染色法：红细胞呈桔红色紫红色，中性颗粒呈浅红色，嗜酸性颗粒呈桔红色，淋巴细胞胞质呈浅蓝色，单核细胞胞质呈蓝灰色。

2.姬姆萨染色法：红细胞呈浅紫红色，白细胞核呈紫蓝色，中性颗粒呈浅红色，嗜酸性颗粒呈桔红色，淋巴细胞胞质呈浅蓝色，单核细胞胞质呈灰蓝色。

3.瑞-姬混合染色法：红细胞呈紫红色，白细胞核呈蓝紫色，中性颗粒呈浅红色，嗜酸性颗粒呈桔红色，淋巴细胞胞质呈浅蓝色，单核细胞胞质呈蓝灰色。

4.罗曼斯基染色法：红细胞呈粉红色，白细胞核呈蓝色，细胞质染色浅，嗜酸、嗜碱颗粒分明。

四、血液涂片在临床上的应用

（一）溶血性疾病

海因茨小体性贫血：循环中的氧化剂作用于红细胞血红蛋白的两个基本位点，珠蛋白中氨基酸的巯基和亚铁。珠蛋白氧化可生成沉淀并形成海因茨小体，铁氧化可形成高铁血红蛋白血症，高铁血红蛋白血症和海因茨小体可以发生于同一个患病动物，但通常一个占主导地位。

发生原因：摄入了氧化物引起的，如洋葱；或者是一些药物的氧化作用导致的，如对乙酰氨基酚。

特征：氧化的血红蛋白沉淀附着于红细胞膜，呈鼻状突起；海因茨小体已经脱离的也能观察到，这些细胞称为咬损红细胞；偏心红细胞，是缺乏中央灰白区域的红细胞，所有的血红蛋白都集中于红细胞的一侧，红细胞的另一侧，在清晰的细胞膜旁边是一小块未着色的细胞质区域(图1）。

（二）犬巴贝西虫病

是蜱传播的犬血液原虫病，病原为犬巴贝西虫或吉氏巴贝西虫，巴贝西可引起血管内溶血性贫血，通常以血红蛋白血症和血红蛋白尿为特征，在外周血液涂片中，巴贝西以泪滴状存在于红细胞内，长约3um（犬巴贝西虫、图2）、1.5um(吉氏巴贝西、图3）。

图1 犬采食洋葱后红细胞出现海因茨小体

图2 犬巴贝西虫感染

图3 犬吉氏巴贝西虫感染

（三）中毒性嗜中性粒细胞

犬发生严重炎性疾病和毒血症时，嗜中性粒细胞的形态学变化十分明显，形态学变化的程度与炎症和毒血症的强度成比例。中毒性嗜中性粒细胞的形态特征：细胞质呈弥散性嗜碱性——细胞质颜色变为蓝灰色；细胞质空泡化——细胞质形成不规则的空泡；Dohle小体——一个或多个不规则的嗜碱性细胞质包涵体（图4）；细胞核形状异常——不规则分叶或出现环形核。

图4 中毒犬嗜碱性细胞Dohle小体

（四）传染源性嗜中性粒细胞

犬埃立希体、犬肝簇虫和组织胞浆菌，在其嗜中性粒细胞中可以观察到相应的微生物（图5）；在嗜中性粒细胞和淋巴细胞的胞浆内偶尔可以观察到犬瘟热包涵体（图6）。

图5 犬埃利希体感染

图6 犬瘟热感染嗜中性粒细胞包涵体

（作者单位：贺星亮，公安部南京警犬研究所，210012；杨武红，湖南省公安厅警犬基地，410000）

（本文照片由作者提供）

（编辑：李 冰）