糖尿病患者尿中nephrin蛋白的表达及临床意义

张 洋,肖庆飞,赵永利,陈 燕,屈智慧

(吉林大学第一医院二部 肾病科,吉林 长春130031)

糖尿病患者尿中nephrin蛋白的表达及临床意义

张 洋,肖庆飞,赵永利,陈 燕,屈智慧*

(吉林大学第一医院二部 肾病科,吉林 长春130031)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的微血管合并症，其早期临床标志物是微量白蛋白尿，而蛋白尿的产生与足突裂孔蛋白nephrin表达异常有关，足细胞功能障碍是糖尿病肾病发生发展的重要因素[1]。有研究表明：Nephrin是由肾小球足细胞表达，定位于肾小球裂孔膜上的跨膜蛋白，其参与维持肾小球滤过膜的完整性[2]。DN早期出现足细胞损伤，其表面nephrin蛋白与骨架蛋白结合减弱，nephrin从足细胞脱落，随尿液排出体外[3]。本文探讨nephrin蛋白对早期糖尿病肾病的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例来源于2010年至2016年于我院内分泌科及肾病科住院诊断为2型糖尿病的患者88例，所有病例病程10年以上，男性40例，女性48例，2型糖尿病诊断符合1999年WHO糖尿病的诊断标准，年龄在18岁以下，80岁以上的予以排除,所有患者均排除心脏、肝脏、其他肾脏疾病以及感染性疾病，排除肿瘤、外伤、风湿性疾病,且近期未发生糖尿病酮症酸中毒或高渗性昏迷，同时近2个月未使用过ACEI或ARB类降压药物。为减少尿液浓度对检测结果的影响，尿白蛋白及尿nephrin蛋白均除以尿肌酐校正。借鉴Mogensen分型标准分为糖尿病组(DM)：UAER<20 μg/min[相当尿白蛋白的排泄率(ACR)<30 μg/mg];早期糖尿病肾病组(DN1)：20 μg/min≤UAER<200 μg/min(相当于ACR30-300 μg/mg);临床糖尿病肾病组(DN2):UAER≥200 μg/min(相当ACR>300 μg/mg);正常对照(N)组40例，男性18例，女性22例，均为我院健康体检者，平均年龄48.55±18.54岁。

1.2 标本收集

所有患者留取晨尿10 ml，2 000 r/min离心5分钟，收集上清液，-20℃保存备用，用于尿nephrin蛋白的测定。

1.3 主要试剂与仪器

人nephrin蛋白酶联免疫分析试剂盒(美国R&D System公司产品)，酶标仪，全自动生化分析仪，-70℃冰箱，离心机。

1.4 方法

1.4.1 血指标的检测 各组患者均在晨起空腹情况下检测，用全自动生化分析仪检测血清空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯。采用免疫分析法测定糖化血红蛋白。同时测量患者的血压，计算其体重指数。

1.4.2 尿液白蛋白的检测 各组患者均用免疫透射比浊法检测尿蛋白，每个月1次，共2次，取平均值。用全自动生化分析仪检测尿肌酐。

1.4.3 尿液nephrin蛋白的检测 采用酶联免疫分析法(具体步骤见操作说明书)检测尿中的nephrin,为减少受试者尿液浓度变化对测试结果的影响，结果均除以尿肌酐的结果表示，即尿nephrin/尿肌酐(μg/mg)表示，每个样本检测两次，取平均值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组一般临床资料比较 见表1。DM组、DN1组、DN2组与NC组相比，在年龄、性别，体重指数方面差异无显著意义。但收缩压、舒张压明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组生化指标的比较 见表2。DM组、DN1组、DN2组与NC组相比，在空腹血糖、糖化血红蛋白、胆固醇及甘油三酯方面明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。各组相比，仅DN2组的血尿素氮与血肌酐高于其他各组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组临床指标比较

*与NC组相比P<0.05

表2 各组生化指标比较

*与NC组相比P<0.05

2.3 各组Unephrin/UCR与ACR 的比较 见表3。NC组患者尿中检测到少量nephrin蛋白，与DM组相似，但DN1组尿nephrin蛋白的排泄量(Unephrin/UCR)较NC组与DM组进一步升高，差异有显著意义(P<0.01)。DN2组Unephrin/UCR较DN1组有显著升高，差异显著(P<0.01)。 DM组尿白蛋白的排泄率与NC组相似，DN1组ACR较DM组与NC组明显增高，差异有显著意义(P<0.01)。DN2组ACR较DN1组进一步升高，差异有显著意义(P<0.01)。Unephrin/UCR与ACR有相关性，r=0.539(P<0.05)。

表3 各组Unephrin/UCR与ACR 的比较

*与NC组相比P<0.01，▲与DN1相比P<0.01

3 讨论

Nephrin蛋白是1998年瑞典著名教授Karl Tryggvason在研究先天性肾病综合征芬兰型时发现的,它是肾小球滤过屏障上皮细胞足突之间裂孔隔膜上第一个被确定的蛋白[4]。其在足突裂孔膜处形成“拉链样结构”，它的缺失或氨基酸序列的改变，会导致裂孔膜的破坏，进而产生大量尿蛋白[5]。

Doublier等[6]证实糖尿病早期肾小球nephrin蛋白代偿性增加，足细胞骨架蛋白重新分布导致其与nephrin蛋白的解离，从而nephrin蛋白从尿液排出，说明nephrin是糖尿病早期肾脏损伤的标志物。Patari[7]用Western印记法检测了1型糖尿病患者尿中的nephrin蛋白，表明nephrin 是可作为预测糖尿病肾脏并发症的有用指标。Wada Y[8]利用各种肾病动物模型证实，nephrin可以作为预测足细胞损伤的生物标志物。综上说明nephrin可能与DN早期改变有关，并促进肾小球滤过功能的丧失。

我们的前期工作发现，糖尿病大鼠早期出现白蛋白尿,并且早于肾功能的改变，说明白蛋白尿是糖尿病早期肾损害的标志。随着尿蛋白的增多，病理改变的加重，大鼠肾脏nephrin蛋白表达降低，提示nephrin蛋白参与蛋白尿的产生与发展[9]。这也为nephrin蛋白从足细胞脱落，从尿中排出提供了佐证。

本研究发现，DM组、DN1组、DN2组三组之间，具有显著差异的是ACR与Unephrin/UCR两项指标。在正常的健康人群的尿液中，我们可以检测到少量的nephrin蛋白，排出量与糖尿病组患者相近，这与有些学者的研究结果有所不同。比如程亮[10]研究表明nephrin蛋白在正常健康人群的尿液中不出现。解释这种差异的原因是nephrin蛋白可能在其他组织有一些微弱表达。比如Ahola[11]等发现nephrin mRNA不但在大鼠肾小球有强表达，在其脾脏也有微弱表达。Liu[12]等首次报道了出生后1-6周的小鼠睾丸组织内有高水平nephrin mRNA表达。所以，在正常人的尿液中可能存在nephrin蛋白。

本研究发现，在早期糖尿病肾病患者(DN1)，尿nephrin蛋白排出比DM组升高，差异有统计学意义，而临床糖尿病肾病的患者(DN2)，尿nephrin蛋白排出比DN1组进一步升高，差异有统计学意义。随着DN病情的进展，尿nephrin的排泄有逐渐增多的趋势。这与糖尿病肾病患者尿白蛋白(ACR)的排泄趋势相同。研究发现，尿nephrin蛋白排出与ACR呈正相关，ACR目前是糖尿病肾病分期的主要指标，综上所述，nephrin蛋白在早期预测DN中具有非常重要的作用。

[1]Wolf G,Ziyadeh FN.Cellular and molecular mechanisms of proteinuria in diabetic nephropathy[J].Nephron Physiol,2007,106(2):26.

[2]WolfG，Chen s，Ziyadeh FN，et al．From the periphery of glomerular capillary wall toward the center of disease：podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy[J]．Diabetes，2005，54(6)：1626.

[3]Zelmanovitz T,Gerchman F,Balthazar AP,et al.Diabetic nephropathy [J].Diabetol Metab Syndr,2009,(1):1186.

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[7]Patari A,Forsblom C,Havana M,et al .Nephrinuria in diabetic nephropathy of type 1 diabetes[J].Diabetes,2003，52(12):2969.

[8]Wada Y,Abe M,Moritani H,et al.Potential of urinary?nephrin?as a biomarker reflecting podocyte dysfunction in various kidney disease models[J].Exp Biol Med,2016,241(16):1865.

[9]屈智慧，杨立志，赵 颖,等.糖尿病大鼠蛋白尿与肾脏病理及nephrin的相关性研究[J].中国实验诊断学,2011,15(9):1441.

[10]程 亮，俞伟男，胡 文,等.糖尿病肾病患者尿足细胞相关蛋白nephrin的表达及意义[J].转化医学杂志，2013,2(1)：15.

[11]Ahola H,Wang SX,Luimula P,et al..Cloning and expression of the rat nephrin homolog[J].Am J Pathol,1999,155(3):907.

[12]Liu L,Aya K,Tanaka K,et al.Nephrin is an important component of the barrier system in the testis[J].Acta Med Okayama,2001,55(3):161.

吉林大学第一医院二部科研专项基金(B04)

*通讯作者

1007-4287(2017)09-1376-03

2017-03-15)