急性白血病病人外周血NK细胞检测的临床意义

孔令环，刘 穹，邢明雨，韩 梅，肖中平，王新梅

(吉林省人民医院，吉林 长春130021)

急性白血病病人外周血NK细胞检测的临床意义

孔令环*，刘 穹，邢明雨，韩 梅，肖中平，王新梅

(吉林省人民医院，吉林 长春130021)

目的探讨急性白血病病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)细胞检测的临床意义。方法用流式细胞术检测18例正常对照及54例急性白血病病人外周血NK细胞占淋巴细胞百分比，NK细胞膜活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A及穿孔素、颗粒酶的表达。结果(1)白血病初治组NK细胞数量显著低于正常对照组(P<0.05)，缓解组、复发组与正常对照组均无显著性差异(P>0.05)；(2)初治组、复发组活化性受体NKG2D均显著低于正常对照组(P<0.05)；初治组、缓解组、复发组抑制性受体NKG2A与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。(3)初治组、复发组的穿孔素表达均显著低于正常对照(P<0.05)。结论NK细胞数量减少及NKG2D、穿孔素表达减少可能与白血病病人发病及复发有关。

白血病；急性；NK细胞；受体；穿孔素；颗粒酶

(ChinJLabDiagn,2017,21:1311)

急性白血病是严重威胁人类健康的重大疾病，其发生、发展与机体免疫功能紊乱有关[1,2]；而导致白血病难以治愈和容易复发的原因也与机体免疫功能的低下及免疫逃逸机制形成有关。NK(CD3-CD16+CD56+)细胞作为机体免疫系统的重要组成成分，不需要抗原致敏，即可非特异杀伤靶细胞。本研究通过检测外周血NK细胞数量及活化性受体及抑制性受体的表达，来探讨NK细胞数量、功能的变化在急性白血病发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取本院2016年1-12月急性白血病住院病人54例为研究对象，其中初治组22人，缓解组16人，复发组16人。初治组男13例，女9例，年龄22-68岁，ALL 6例，M26例，M56例，M34例，均经MICM 分型确诊。对照组18例，均为本院健康体检者，男10例，女8例，年龄31-53岁。标本的留取均获得知情同意。

1.2 试剂和仪器

单抗购自BCM公司，鼠抗人CD3-ECD、CD16-PC5 、CD56-PC5、CD314-FITC(活化性受体NKG2D)、CD159- PE(抑制性受体NKG2A)、胞质蛋白perforin-FITC(穿孔素)、granzyme β-PE(颗粒酶β)、同型对照、溶血素、破膜剂；流式细胞仪为美国贝克曼公司的多参数EPICS XL型流式细胞仪，应用EXPO32ADCXL4 Color软件分析，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，结果以百分率表示。

1.3 方法

受试者于清晨空腹采静脉血2 ml，EDTA抗凝。

1.3.1 流式细胞术检测胞膜蛋白 1号Falcom管加入抗体CD3-ECD、CD16- PC5、CD56-PC5、NKG2A-PE、NKG2D-FITC各20 μl用于标记NK细胞和NKG2A、NKG2D；再加100 μl外周血，充分混匀，室温避光孵育15 min，加入溶血剂500 μl，混匀，室温避光10 min，加入适量PBS，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加500 μl PBS，上机分析NK细胞及受体表达率。由此检出的NK细胞包含CD16低表达CD56bright 亚型和CD16高表达的CD56dim亚型。

1.3.2 流式细胞术检测胞质蛋白 2号Falcom管加入抗体CD3-ECD、CD16- PC5、CD56-PC5各20 μl，再加100 μl外周血,充分混匀，室温避光孵育15 min,加入Reagent A 100 μl，混匀，室温避光10 min，1倍溶血素2 ml，混匀避光10 min，离心，去上清，再将50 μl Reagent B加入上述溶血后的试管中，室温避光10 min，破膜、固定，加PBS液1 ml洗1次，离心弃上清，依次加入perforin-FITC、granzyme β- PE单抗各20 μl，4℃避光孵育15 min，加PBS液1 ml洗涤2遍，加500 μl PBS，上机分析NK细胞胞浆内穿孔素、颗粒酶-β表达阳性率。

1.4 统计学处理

由SPSS17.0统计软件完成统计分析，所有数据以(均值±标准差)表示，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性白血病病人外周血NK细胞占淋巴细胞的百分比

急性白血病病人初治组外周血NK(CD3-CD16+CD56+)细胞占淋巴细胞的百分比显著低于正常对照组(P<0.05)；急性白血病病人缓解组及复发组外周血NK(CD3-CD16+CD56+)细胞占淋巴细胞的百分比与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.2 急性白血病病人NK细胞膜活化性受体、抑制性受体表达

急性白血病病人初治组、复发组活化性受体NKG2D均显著低于正常对照(P<0.05)；缓解组活化性受体NKG2D与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。急性白血病病人初治组、缓解组、复发组抑制性受体NKG2A与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.3 急性白血病病人外周血NK细胞胞质穿孔素、颗粒酶-β表达

急性白血病病人初治组、复发组的穿孔素表达均显著低于正常对照组(P<0.05)；缓解组的穿孔素表达与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。急性白血病病人初治组的颗粒酶-β的表达显著低于正常对照组(P<0.05)；缓解组、复发组的颗粒酶-β的表达与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 外周血NK细胞及表面受体及胞质蛋白表达(均值±标准差)%

注：与对照组比较，aP<0.05

3 讨论

自然杀伤(NK)细胞是机体免疫系统的重要组成成分，不需要抗原致敏即可非特异杀伤靶细胞。正常情况下NK细胞约占外周血的10%-20%，有研究报道[3，4]，NK细胞数量减少可导致机体免疫功能下降，往往与肿瘤的发生发展有着密切联系。贺建霞等报道[5]，非霍奇金淋巴瘤初治患者外周血NK细胞数低于健康人；郑淑霞等[3]报道，AML急性期和淋巴瘤急性期NK细胞数与对照组比有显著差异。本研究发现，急性白血病初治组NK细胞数量减低，与正常对照组有显著性差异(P<0.05)；缓解组、复发组NK细胞数与正常对照无显著性差异，与报道一致。

NK细胞的抗肿瘤活性与其表面受体的表达水平有密切联系，NK细胞的表面受体有许多种，根据其功能可分为活化性受体和抑制性受体。其中活化性受体NKG2D是C型凝集素样受体，是NKG2家族中免疫活性最强的活化性受体，也是目前公认的在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用的受体，表达于绝大多数NK细胞表面，其表达水平几乎决定了机体NK细胞免疫应答的强弱，在抗肿瘤免疫中起重要作用[6]。本研究发现，白血病初治组、复发组的NK细胞活化性受体NKG2D均显著低于正常对照组(P<0.05)；缓解组活化性受体NKG2D与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。 初治组、缓解组、复发组抑制性受体NKG2A与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。因此，考虑白血病病人的免疫功能降低与NKG2D表达减少有关，可能是白血病病人发病及复发的原因,与报道一致[7]。缓解组NKG2D表达明显提高，提示经过化疗后病人的免疫功能得到恢复，与顾科峰[8]等报道一致。

研究还发现，白血病初治组的穿孔素及颗粒酶-β 表达均显著低于正常对照组(P<0.05)，而缓解组病人的穿孔素及颗粒酶-β表达与正常对照组无显著性差异(P>0.05)；可能是白血病发病时NK细胞功能不足的一种表现。复发组的穿孔素表达显著低于正常对照组(P<0.05)，至于穿孔素在白血病复发中有何意义，由于标本量少，尚需进一步研究。

综上所述，白血病病人初治组NK细胞数量减少，初治组、复发组活化性受体NKG2D及穿孔素表达均减少，而缓解期均恢复正常。表明NK细胞的这一变化可能与疾病的状态有关，所以，动态监测以上指标可进行白血病病情监测及预后判断。

[1]齐 红，石 虹，刘玉侠，等.253例恶性肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群的检测及其临床意义分析[J].中国实验诊断学，2009，13(11)：1589.

[2]杨德芬.外周血T淋巴细胞亚群检测在恶性肿瘤中的应用及临床意义[J].海南医学院学报，2013，19(10)：1390.

[3]郑淑霞，谢若腾，官瑞婷，等.恶性血液病患者外周血NK细胞数量变化及意义[J].中国实验血液学杂志，2015,23(4)：1133.

[4]Bari A,Marcheselli L,Sacchi S,et al.Prognostic models for diffuse large B-cell lymphoma in the rituximab era:a never-ending story[J].Ann Oncol,2010,21:1486.

[5]贺建霞，赵志强，王艳峰，等.非霍奇金淋巴瘤患者外周血T细胞亚群及NK细胞检测的临床意义[J].白血病.淋巴瘤,2013，22(7)：436.

[6]常 鑫，马 莉，曾小菁，等．白血病患者NK细胞表面NKG2D受体及其配体MICA/B的研究[J]．中国免疫学杂志，2009,25(2):174．

[7]Sun C,Sun H,Zhang C,et al.NK cell receptor imbalance and NK cell dysfunction in HBV infection and hepatocellular carcinoma[J].Cell Mpl Immunol,2015,12(3):292．

[8]顾科峰，陈琳军，邓晓辉，等．恶性血液病治疗恶性血液病患者治疗前后外周血NK细胞亚群变化的特点及其临床意义[J]．实用医学杂志，2013，29(13)：2154．

Significanceofnaturalkillcellperipheralbloodofpatientswithacuteleukemia

KONGLing-huan,LIUQiong，XINGMing-yu,etal.

(JilinProvinceHospital,Changchun130021,China)

ObjectiveTo explore The clinical significance of NK(CD3-CD16+CD56+) cell in peripheral blood of acute leukemia.MethodsBy flow cytometry，the percentage of NK cell in peripheral blood lymphocytes was detected in 54 acute leukemia and 18 healty adults .NK cell activation receptor (NKG2D),inhibitory receptor (CD159),perforin and granzyme of patients were also detected.Results(1)The percentage of NK cell in newly diagnosed acute leukemia patients was significantly lower than of normal controls(P<0.05).But it had no significant of the CR group and relapse group than that of normal controls(P>0.05).(2)The expression of NKG2D both in the newly diagnosed group and relapse group were significantly lower than that of normal controls(P<0.05).But the expression of NKG2A among the 3 groups had no significant than that of normal controls(P>0.05).(3)The expression of perforin and granzyme both in the newly diagnosed group and relapsegroup significantly lower than that of normal controls(P<0.05).ConclusionPerhaps,the lowered percentage of NK ,lowered expression of NKG2D and perforin had correlation with pathogenesy and relapse of acute leukemia

Leukemia;Acute;Natural killer cell;Receptor;Perforin;Granzyme

吉林省科技厅项目(20150101145JC)

*通讯作者

1007-4287(2017)09-1311-03

R733.71

：A

2017-03-04)