驯鹿EGFR基因克隆及序列分析1)

王强辉 翟健程 夏彦玲 刘伟石 李和平

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

驯鹿EGFR基因克隆及序列分析1)

王强辉 翟健程 夏彦玲 刘伟石 李和平

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

以快速生长期雄性驯鹿(Rangifertarandus)鹿茸顶端表皮组织为研究材料，提取其顶端表皮组织总RNA，参考GenBank数据库中牛、羊的表皮生长因子受体(EGFR)基因序列设计同源引物；采用RT-PCR技术、分子克隆技术首次成功获得雄性驯鹿茸顶端表皮组织EGFR基因编码区部分cDNA序列，片段大小为910 bp；Blast比对发现驯鹿EGFR基因与牛、羊、马、人、鲸、野猪的同源性分别是97%、96%、88%、86%、92%、89%，同源性均在85%以上，表明驯鹿EGFR基因在进化上比较保守；构建系统进化树发现驯鹿EGFR基因与牛亲缘关系最近，与人的亲缘关系最远；最后通过在线分析软件预测获得EGFR基因序列对应mRNA最小自由能二级结构。

驯鹿；EGFR基因；RT-PCR；分子克隆；生物信息学

表皮生长因子受体(EGFR)是细胞表面具有配体介导的受体酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，是重要的ErbB受体蛋白家族成员，又名ErbB-1[1]。EGFR分子具有3个结构域，分别是与配体结合区、跨膜区以及羧基端具有受体酪氨酸激酶活性的区域[2]。目前已经发现的ErbB家族成员有EGFR/ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4[3]，其中对EGFR研究最为广泛。研究发现，EGFR存在6种配体类型，分别是表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、安非调节素、Bcta-celluin、肝素结合样EGF、表皮调节素(EPR)，其中EGF、TGF、Qmhiregulin只能和EGFR结合，其余的和其他ErbB家族配体共同结合发挥作用[4]。大量研究表明，EGFR基因的过量表达或者变化与人类肿瘤的发生、转移、浸润有着密切的关系[5]，其作用机理是EGFR与配体结合进而激活本身固有的酪氨酸激酶的活性，酪氨酸残基进行自身磷酸化活化EGFR，活化后的EGFR可以通过一系列信号转导通路激活下游的生长因子活性，从而刺激细胞增殖、分化、抗凋亡等[6]。EGFR基因的表达直接影响到生命活动，它是一个多效基因，其突变和过量表达都会使得正常生命活动的改变，例如已有研究表明在癌症细胞中EGFR基因总存在过表达的现象[7]，这就使得EGFR基因研究为癌症治疗提供了新的方向，孙梦梅的研究表明，人源性EGFR抗体能够抑制肿瘤细胞增殖和扩散[8]。鹿茸作为一种能够完全再生的骨质性器官，且快速生长期细胞分裂速度远远超过肿瘤细胞分裂速度(约为癌细胞分裂速度的30多倍)的正常细胞[9]，对其EGFR基因的探索对于人类疾病治疗以及鹿茸生长研究有着巨大的价值。

驯鹿(Rangifertarandus)是唯一雌雄都具角的鹿科动物，在我国仅分布在大兴安岭地区，在敖鲁古雅河畔形成了特有的鄂温克驯鹿文化[10]。驯鹿因其独特的生理和文化特征闻名世界，也吸引着广大学者的关注。鹿茸研究一直是鹿科动物研究的热点，尤其鹿茸再生机理和神奇的细胞分裂速度一直被认为是再生生物学领域[11]和生物医学领域[12]重要的生物模型。鹿茸细胞的快速增殖和生长因子以及生长因子受体的作用息息相关。冯海华等研究表明，IGF-1对鹿茸中心细胞增殖有着重要作用，并且不同生长时期影响不同[13]。杨晓光在马鹿鹿茸顶端茸皮和软骨组织转录组研究中发现，EGFR基因是茸皮组织中高表达的生长因子受体基因之一[14]，但GenBank中没有鹿源性EGFR基因的任何记录，因此笔者参考近缘物种牛、羊等的EGFR基因序列设计同源引物，应用RT-PCR技术、T-A克隆技术展开对EGFR基因的探索，首次成功克隆获得EGFR基因编码区的部分cDNA序列，并对此序列进行生物信息学分析，为驯鹿EGFR基因的后续研究提供可参考的试验依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与保存

选用辽阳千山呈龙科技有限公司养鹿场引自根河市敖鲁古雅乡的成年健康雄性驯鹿作为试验对象，于2016年鹿茸快速生长期切取雄性驯鹿茸顶端大约5 cm，参考Li et al.[15]对马鹿鹿茸顶端组织分层的方法，先将样品表面迅速消毒，纵向剖开，取其顶端表皮组织，采集完后迅速放入液氮中保存备用。

1.2驯鹿茸顶端表皮组织总RNA提取及cDNA的合成

总RNA提取和纯化：运用Trizol法[16]提取总RNA，根据Trizol试剂盒说明步骤提取总RNA，完成总RNA提取后进行纯化，再用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，最后使用紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。

模板cDNA的合成：根据M-MLV3逆转录酶的要求按照20 μL体系合成第一链cDNA，其体系组分为，总RNA2.0 μL、RT-buffer 4.0 μL、dNTPs 2.0 μL、RNase inhibitor 1.0 μL、Oligo-dT 1.0 μL、逆转录酶 1.0 μL、DEPC处理水9.0 μL，反应条件为，42 ℃ 20 min、 99 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min，完成后瞬间离心，放于-20 ℃备用。

1.3 驯鹿EGFR基因的扩增及克隆

引物合成：参考GenBank数据库中牛、羊、印度水牛、犀牛等同源物种EGFR基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0设计引物，由哈尔滨新海生物公司合成。上游引物EGFRF：5′GCACTTTTGAAGACCACT 3′；下游引物EGFRR：5′AACTCACCGATTCCTATT 3′。

EGFR基因扩增与回收：以cDNA为模板、EGFRF为上游引物、EGFRR为下游引物进行PCR反应获取目的基因。PCR反应条件为，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36个循环，循环结束后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。将扩增产物按照凝胶回收试剂盒说明进行回收并纯化，通过以上两步成功获得目的基因。

EGFR基因克隆：取上述步骤中回收产物3.5 μL参照连接体系说明书进行连接，将目的基因成功连入PMD18-T载体中，然后将连有目的基因的载体与大肠杆菌DH5α感受态细胞完成转化，将成功转化的细胞在超净工作台用涂布棒均匀涂在事先准备好的LB固体培养基上，在37 ℃恒温生化培养箱中培养12～14 h，最后经过蓝白斑筛选得到带有目的基因的15个白色菌落，将菌落挑至加有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在恒温摇床培养6～8 h，进行阳性检测。

1.4 驯鹿EGFR基因序列测定

克隆成功的菌液送往吉林库美生物公司进行双向测序，测序结果经过Chromas峰图查看，DNAstar分析，确认测序结果可靠性。

1.5 驯鹿EGFR基因生物学信息分析

测序结果运用DNAstar中SeqMan进行检测校准，对准确的目的序列通过Blast进行初步分析，比对驯鹿EGFR基因与其他物种EGFR基因的同源性，下载同源序列，运用Mega5.0构建系统进化树、DNAman分析对比物种间差异碱基的个数以及位点，运用ViennaRNA Web Services对得到序列所对应的mRNA二级结构进行预测，综合分析驯鹿EGFR基因所携带的生物信息。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取与目的片段扩增

总RNA在1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示5.8S、18S、28S条带清晰无拖带，且28S亮度约为18S亮度的二倍(图1)，提取质量浓度为1 760.4 mg·L-1，OD260/OD280为2.0，表明其质量浓度以及纯度均达到后续试验的要求。

M.DL2000 Marker；A.总RNA。

2.2 驯鹿EGFR基因部分cDNA的克隆及阳性检测

驯鹿EGFR基因扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测发现1条900 bp左右的特异性条带(图2)，将该条带纯化回收克隆，通过对15个克隆菌落的阳性检测，确认克隆成功后(图3)进行双向测序，测序结果经DNAstar拼接获得大小为910 bp基因序列，完全与预期的目的基因大小一致。进一步Blast比对分析，确认此序列是驯鹿EGFR基因编码区的部分cDNA序列。测序结果如下：GCACTTTTGAAGACCACTTTCTGAGCCTCCAGAGGATGTTCAACAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTACATGCAGAGTAGTTACAACCTTTCTTTTCTCAAGACCATCCAGGAGGTTGCTGGCTATGTACTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGAAGATTCCGCTGGAAAACCTGCAGATCATCCGAGGAAATGTGCTTTATGAAAACACCCATGCCTTAGCGGTCTTATCCAACTATGGAGCAAACAAAACCGGACTGAGGGAGCTGCCCTTGAGAAACTTACAGGAAATTCTGCAAGGTGCCGTGCGATTCAGCAACAACCCTGTCCTCTGCAACGTGGAGACCATCCAGTGGCGGGACATCGTCAACCCTGACTTTCTAAGCAACATGACAGGGGACTTTCAGAACCAGCTGAGCAACTGCCCGAAGTGTGATCCAGTCTGTCTCAATGGAAGCTGCTGGGGTGCTGGGAAGGAGAACTGCCAGAAATTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGTTCCGGGCGCTGCCGTGGCAGGTCCCCCAGCGACTGCTGTCACAACCAGTGCGCCGCTGGCTGCACGGGGCCACGGGAGAGTGACTGCCTGGTCTGCCGCAGGTTCCGTGATGAAGCCACTTGCAAGGACACGTGTCCGCCACTCATGCTCTATGACCCTACCACCTACGAGATGAAGGTCAACCCGCTGGGGAAGTACAGCTTTGGTGCCACCTGTGTCAAGAAGTGTCCCCGTAACTATGTGGTGACAGACCACGGCTCATGCGTCCGCGCCTGCAGTTCTGACAGCCAGGAGGTAGAAGAGGATGGTGTCCGCAAGTGTAAAAAGTGTGACGGGCCTTGTGGCAAAGTTTGTAACGGAATAGGAATCGGTGAGTT.

M．DL2000 DNA marker；1-3为驯鹿EGFR基因部分cDNA扩增片段。

图2驯鹿EGFR基因RT-PCR扩增结果

M．DL2000 DNA Marker；1-15为EGFR基因部分cDNA克隆片段。

2.3 驯鹿EGFR基因序列同源性比较

为进一步了解驯鹿与其他哺乳动物EGFR基因的同源性，将获得的驯鹿EGFR基因序列在GenBank中经Blast对比，并下载与其他哺乳动物同源区段，结合DNAman综合对比分析，驯鹿EGFR部分cDNA序列与其他物种序列的综合对比见图4，结果显示其与牛科动物中印度水牛、野牛、家牛同源性最高，为97%，其次为羊96%、小须鲸92%、野猪89%、马88%、人86%。这就说明驯鹿EGFR基因在进化上是相对保守且和偶蹄目动物具有高度相似性。

图4 驯鹿EGFR基因与其他哺乳动物基因系统进化树

2.4 驯鹿EGFR基因系统进化树构建

根据驯鹿EGFR基因部分cDNA序列，经Blast对比后从GenBank数据库中下载与驯鹿此段序列同源的人、牛、羊、马、野猪、小须鲸的序列经分析整理，运用Mega5.0构建系统进化树(图4)。由图4可见，驯鹿EGFR基因与牛、羊亲缘关系最近，与人和马亲缘关系最远，与小须鲸的亲缘关系较近、野猪次之，这一结论符合经典分类学规律。

2.5 驯鹿EGFR基因mRNA二级结构预测

根据测序获得的驯鹿EGFR基因部分cDNA序列，运用在线分析软件ViennaRNA Web Services对EGFR基因的cDNA相应的mRNA进行最小自由能二级结构预测，预测结果见图5。

图5 MFE二级结构预测

3 讨论

鹿茸周期性生长和神奇的增殖速度使得其一直成为生命研究领域较为热门的话题，随着研究的不断深入(从早期鹿茸表形态研究到现在分子作用机理以及基因表达层面的研究)，使得研究成果不断向实践转化，为攻克目前生物医学难题奠定基础。EGFR基因作为生命活动的重要受体基因之一，对于生命活动的正常运行起着至关重要的作用。驯鹿作为唯一雌雄都长角的鹿科动物，对于某些功能基因在雌雄之间的探索区别其他单一性别长角的鹿科动物，这就使得本研究具有特殊的生物学意义。

在本研究中成功克隆获得驯鹿EGFR基因的部分cDNA序列，其片段大小为910 bp，通过Blast、DNAman、DNAstar、MEGA5.0分析得到EGFR基因在物种进化中比较保守，与其他动物如牛、羊、猪、马等的同源性均在85%以上，是重要的功能基因。2015年杨晓光在马鹿鹿茸顶端茸皮和软骨组织转录组研究中发现，EGFR基因在茸皮组织中表达，且表达量相对较高；通过KEGG信号通路分析，EGFR基因与鹿茸生长有着重要的联系[14]。本研究运用DNAman的多序列对比功能将获得的驯鹿EGFR基因的部分序列与牛、羊、马、鲸、猪、人对比，发现7个物种EGFR基因部分cDNA序列仅在211、235、253、453、481、604、604、652、664、709、841 bp十个基因位点有明显差异，其他位点碱基同源性极高；在MEGA5.0系统进化树构建中发现驯鹿EGFR基因与牛的亲缘关系最近，与人亲缘关系最远，其中羊、小须鲸、野猪、马与驯鹿的亲缘关系介于牛和人之间，依据分类学特点理论上应该是牛、羊、野猪同属偶蹄目其亲缘关系应该较马、鲸、人与驯鹿近，但实验结果表明野猪EGFR基因在分子层面与驯鹿EGFR基因的亲缘关系较远；最后在用在线分析软件ViennaRNA Web Services对驯鹿EGFR基因部分cDNA对应的mRNA进行最小自由能二级结构预测(图5)，从图中可以看出，mRNA二级结构茎区和环区分布比较合理，结构相对比较稳定，是快速生长期驯鹿茸表皮组织EGFR基因稳定表达的结构基础。

基于前人对EGFR基因研究，笔者认为通过对驯鹿EGFR基因的探索，尤其对EGFR基因序列分析、调控作用原理以及信号通路的研究，对于鹿茸快速生长机理的深入了解和生物模型的构建有着广阔的前景，且能为后续鹿茸生长发育分子生物学研究提供可供参考的试验依据。

[1] ULLRICH A, COUSSENS L, HAYFLICK J S, et al. Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells[J]. Nature,1984,309:418-425.

[2] YARDEN Y, SLIWKOWSKI M X. Untangling the ErbB signaling network[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology,2001,2(2):127-137.

[3] 柏素云,王蔚林,李冠武,等.EGFR-STAT3信号转导通路与肿瘤[J].肿瘤防治杂志,2004,11(9):989-991.

[4] RAYMOND E, FAIVRE S, ARMAND J P. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase as a target for anticancer therapy[J]. Drugs,2000,60(S1):15-23.

[5] MITSUDOMI T, YATABE Y. Epidermal growth factor receptor in relation to tumor developme-nt: EGFR gene and cancer[J]. Febs Journal,2010,277(2):301-308.

[6] YARDEN Y. The EGFR family and its ligands in human cancer: signalling mechanisms and therapeutic opportunities[J]. European Journal of Cancer,2001,37(S4):3-8.

[7] CIARDIELLO F, TORTORA G. Epidermal growth factor receptor (EGFR) as a target in cancer therapy: understanding the role of receptor expression and other molecular determinants that could influence the response to anti-EGFR drugs[J]. European Journal of Cancer,2003,39(10):1348-1354.

[8] 孙梦梅.抗EGFR人源化抗体的构建、表达、纯化和功能分析[D].合肥:安徽大学,2011.

[9] LI C, YANG F, SHEPPARD A. Adult stem cells and mammalian epimorphic regeneration-insights from studying annual renewal of deer antlers[J]. Current Stem Cell Research & Therapy,2009,4(3):237-251.

[10] 卡丽娜.论驯鹿鄂温克人的驯鹿文化[J].黑龙江民族丛刊,2007(2):174-178.

[11] 褚文辉,王大涛,鲁晓萍,等.基于干细胞的器官再生研究模型-鹿茸[J].中国组织工程研究,2013,17(45):7961-7967.

[12] 鲍加荣,李春义,邢秀梅,等.鹿茸再生及干细胞研究进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(51):10163-10166.

[13] 冯海华,闭兴明,赵丽红,等.胰岛素样生长因子1对不同生长时期鹿茸生长中心细胞体外增殖的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(37):7373-7376.

[14] 杨晓光.马鹿(Cervuselaphus)鹿茸角顶端茸皮与软骨组织转录组研究[D].哈尔滨:东北林业大学,2015.

[15] LI C, CLARK D E, LORD E A, et al. Sampling technique to discriminate the different tissue layers of growing antler tips for gene discovery[J]. Anatomical Record,2002,268(2):125-130.

[16] SIMMS D, CHOMCZYNSKI P. TRIzolTM: A new reagent for optimal single-step isolation of RNA[J]. Focus,1993,15(4):532-535.

CloningandSequenceAnalysisofEGFRGeneinReindeer//

Wang Qianghui, Zhai Jiancheng, Xia Yanling, Liu Weishi, Li Heping
(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(9)：77-80.

Reindeer；EGFRgene； RT-PCR； Molecular cloning； Bioinformatics

Q781

1)国家林业局珍稀濒危物种野外救护与繁育项目(2012)；中央高校基本科研业务专项资金项目(2572016AA42)。

王强辉，男，1994年8月生，东北林业大学野生动物资源学院，硕士研究生。E-mail：wangqianghui@nefu.edu.cn。

李和平，东北林业大学野生动物资源学院，教授。E-mail：lihepinghrb2002@nefu.edu.cn。

2017年3月24日。

责任编辑：程 红。

The epidermal tissue of antler-tip of male reindeer was used as the research materials, and total RNA was extracted from it. The homologous primers were designed according to the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene sequence of cattle and sheep in GenBank database. Part cDNA sequences EGFR gene in coding region, which had 910 base pairs in length, was first obtained by RT-PCR and the molecular cloning technique. TheEGFRgene homology between reindeer and cattle, sheep, horse, human, whale, and wild boar respectively was 97%, 96%, 88%, 86%, 92% and 89% by the bioinformatics and Blast analysis. The homologies, all of them, were above 85%. The reindeerEGFRgene was more conserved in its evolution. In the construction of phylogenetic tree, the genetic relationship of reindeer EGFR gene with cattle was the closest, and with human was the furthest. The minimum free energy secondary structure of theEGFRgene sequence was predicted by the online analysis software.