补体抑制活性物质鱼腥草总多糖中内毒素的去除

2017-09-23张娟娟张庆琳卢燕陈道峰

中国中药杂志 2017年17期

张娟娟　张庆琳　卢燕陈道峰

[摘要] 为建立补体抑制活性鱼腥草总多糖中内毒素的去除方法，将琼脂糖疏水色谱及聚丙烯酰胺凝胶过滤色谱分别与多粘菌素亲和吸附色谱联用纯化鱼腥草多糖。以显色基质比色法检测纯化前后内毒素的含量变化，细胞溶血法检测纯化前后体外抗补体活性变化。结果发现，疏水色谱与亲和吸附色谱的联用对内毒素的清除效果优于凝胶过滤色谱与亲和吸附色谱的联用，其清除率达42.85%。内毒素清除前后，抗补体活性没有明显变化。表明疏水色谱与亲和吸附色谱联用可用于清除鱼腥草总多糖中的内毒素且不影响其抗补体活性。

[关键词] 鱼腥草总多糖；内毒素；抗补体；疏水色谱；亲和吸附色谱

Removal of lipopolysaccharides from anticomplementary crude

polysaccharides of Houttuynia Herba

ZHANG Juanjuan， ZHANG Qinglin， LU Yan*， CHEN Daofeng

（School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China）

[Abstract] An AffiPrep Polymyxin column was combined with a Phenyl Sepharose column and a Sephacryl S300 column， respectively， to remove the lipopolysaccharides（LPS） in the anticomplementary crude polysaccharides of Houttuynia Herba. The contents of LPS in the polysaccharides were determined by chromogenic tachypleus amebocyte lysate（TAL）method during the procedure of purifying. The anticomplementary activities of the polysaccharides were also compared before and after the removal of LPS. Less remanent LPS was detected after purified using Penyl Sepharose combined with polymyxin column， with the clearance rate of 42.85%. All the columns had no effect on the anticomplementary activity of the polysaccharides. Penyl Sepharose combined with polymyxin column would be sound for LPS removal of the anticomplementary polysaccharides without reducing their bioactivity.

[Key words] crude polysaccharides of Herba Houttuynia； LPS； anticomplementary； Penyl Sepharose； polymyxin

魚腥草Houttuynia Herba为三白草科Saururaceae蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草和干燥的地上部分，具有利尿通淋、抗炎抗过敏、增强机体免疫力等功效[13]。补体系统（complement system）是将对病原体的识别有效地转化为宿主对最初感染发挥防御功能的主要机制之一。补体的过度激活会引起人体免疫系统的过度反应，参与多种疾病的病理过程[4]，临床上目前尚无理想的治疗药物。近年来，本课题组致力于中药补体抑制剂的研究，分离得到了一些高效、低毒的小分子化合物及大分子多糖类天然补体抑制剂[58]。其中，鱼腥草总多糖抗补体活性较强[9]，同时具有显著的解热和防治内毒素（lipopolysaccharides，LPS）诱导的急性肺损伤药效[1011]，临床开发应用前景良好。

LPS是革兰阴性细菌的细胞壁外层上的特有结构，在革兰阴性细菌感染与疾病演化中起到重要作用。LPS带有极高的热稳定性，与许多大分子蛋白或多糖类在同一数量级[12]，在提取过程中易被保留于活性总多糖中，不易去除。LPS进入人体内后可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等严重后果[1314]。因此，如何从中药提取物中去除LPS成为医药领域研究的热点。

现常用的LPS清除方法主要有活性炭吸附、微孔滤膜、阴离子交换色谱法、疏水色谱与分子筛法、亲和色谱法、吸附法与相分离法[1618]。但吸附法、化学降解、超滤膜、离子交换色谱等内毒素去除方法的选择性不很高，不适于从一些相对分子质量和分子结构与内毒素十分相近的多糖样品中去除LPS，用于多糖内毒素去除的研究较少[15]。目前内毒素去除的主要侧重点已转移到亲和介质方面，可选用多粘菌素B、组氨酸等作为配基[1920]载于基质上制成相应的亲和介质，该法内毒素去除率高、方法选择性好。本实验通过柱色谱联用去除鱼腥草总多糖中的LPS，以显色基质比色法定量检测内毒素含量，比较疏水色谱与亲和吸附色谱的联用及凝胶过滤色谱与亲和吸附色谱的联用对LPS的清除率，同时比较LPS清除前后鱼腥草总多糖体外补体抑制活性的变化，为中药活性多糖药物中LPS的去除提供方法参考。

1 材料

鱼腥草购买于上海养和堂药业连锁经营有限公司，经复旦大学药学院生药教研室卢燕副教授鉴定为三白草科Saururaceae 蕺菜属植物蕺菜H. cordata的干燥地上部分。鱼腥草总多糖为采用课题组前期优化工艺自制[9]。endprint

Sephacryl S300（GE Healthcare）；AffiPrep Polymyxin Matrix（BioRadLaboratories）；Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare）；LPS对照品（Pharmacia Biotech）；显色基质法鲎试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂有限公司）；透析袋（Merck公司，14 000 Da）。氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸及苯酚均为国产AR级，苯酚用前重熏。

电子天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司），TDL4型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Well scan MK3型酶标仪（Thermo Labsystems公司，芬兰）；EYELAOSB2100型旋转蒸发仪（东京理化EYELA公司，日本）精达水浴恒温振荡器；德国Martin Christ RLPHR 12 LD型冷冻干燥器；UV759S 紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；HL2S型横流泵（上海沪西分析仪器厂）；BSZ100型自动部分收集仪（上海沪西分析仪器厂）。

2 方法

2.1 显色基质法[21]定量检测LPS含量

2.1.1 反应试剂的配制按标示量加细菌内毒素检查用水溶解鲎试剂，鲎试剂应于溶解后10 min内使用。按标示量加内毒素检查用水溶解显色基质。按标示量加反应终止剂HCl配制偶氮化试剂1。按标示量加内毒素检查用水溶解偶氮化试剂2，3。

2.1.2 对照品及待测样品溶液的配制精密称取适量对照品，用细菌内毒素检查用水配制成浓度分别为0.01， 0.025， 0.05， 0.1 EU·mL-1或0.1， 0.25， 0.5， 1.0 EU·mL-1。精密称取适量待测样品，加内毒素检查用水配制成待测样品溶液。

2.1.3 阴性对照品溶液的配制取100 μL内毒素标准溶液及100 μL待测样品溶液，加入100 μL细菌内毒素检查用水，混匀，即为阴性对照品溶液。

2.1.4 内毒素含量测定方法取300 μL对照品，加入鲎试剂100 μL，混匀，根据其内毒素浓度范围分别于37 ℃温浴45 min或8 min后，加入显色基质溶液100 μL，混匀，37 ℃温浴6 min，继续加入偶氮化试剂1、偶氮化试剂2和偶氮化试剂3溶液各500 μL，混匀静置5 min，于545 nm下测定其吸光度。

以吸光度值为纵坐标，内毒素浓度为横坐标，建立标准曲线，求回归方程。

阴性对照品溶液或待测样品溶液的内毒素浓度测量法同上。

2.1.5 供试品干扰实验由于要考察试验中各因素对鲎试剂、标准品或待测样品反应的影响，故需进行供试品干扰实验，计算回收率。回收率计算方式如下：

R=（Cs-Ct）/Cr×100%

Cr：选取靠近内毒素标准曲线中点的浓度；Cs：配制含有内毒素浓度为Cr的供试品溶液，其测量所得的内毒素浓度值记为Cs；Ct：未添加内毒素的供试品所测得的内毒素浓度值。

当R在50%～200%时，认为此实验条件下对供试品溶液不存在干扰。若R超出此范围则需进一步对供试品进行稀释，重复供试品干扰实验至R进入50%～200%。一般选择R接近100%时的供试品浓度进行供试品的内毒素含量测定。

2.2 凝胶柱色谱法[22]

Sephacryl S300柱（1.5 cm×50 cm），以三蒸水平衡，再以0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液消毒0.5 h，最后以大于3倍体积的三蒸水洗脱、平衡。取20 mg的鱼腥草粗多糖，以适量的三蒸水溶解，1万 r·min-1离心10 min，上清上样，然后以三蒸水洗脱（0.8 mL·min-1），10 min/管收集流分。检测每管糖含量（按硫酸苯酚法[9]制备样品溶液，490 nm波长下测定吸光度值），记录洗脱图，根据检测结果合并流分，浓缩、冻干。

2.3 疏水柱色谱法[23]

Penyl Sepharose 6 FF柱（1.5 cm×50 cm），以三蒸水平衡，再以0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液消毒0.5 h，继续以大于3倍体积的2 mol·L-1氯化钠洗脱、平衡。称取20 mg鱼腥草总多糖，以适量的2 mol·L-1氯化钠溶解，1萬 r·min-1离心10 min，上清上样，然后以2 mol·L-1氯化钠洗脱（0.8 mL·min-1），10 min/管收集流分。检测每管糖含量（硫酸苯酚法，490 nm下测定吸光度值），记录洗脱图，根据检测结果合并流分，浓缩、冻干。

2.4 亲和吸附色谱柱法[24]

PBS缓冲液的配制：将62 mL母液A（精密称取71.6 g磷酸二氢钠，溶于1 000 mL超纯水中）与38 mL母液B（精密称取31.2 g磷酸氢二钠，溶于1 000 mL超纯水中）混合，配制成100 mL的0.2 mol·L-1 PBS（pH 7.0）溶液，用时将0.2 mol·L-1 PBS按比例适当稀释成0.05 mol·L-1 PBS。

装AffiPrep Polymyxin柱（1.0 cm×30 cm），以3倍体积的0.1 mol·L-1氢氧化钠再生，再以10倍柱体积的三蒸水平衡，最后以大于3倍柱体积的0.5 mol·L-1 PBS洗脱、平衡。称取10 mg经凝胶柱色谱或疏水柱色谱纯化的鱼腥草总多糖，以适量的0.05 mol·L-1 PBS溶解，1万 r·min-1离心10 min，上清上样，然后以0.05 mol·L-1 PBS洗脱（0.8 mL·min-1），10 min/管收集流分。检测每管糖含量（硫酸苯酚法，490 nm下测定吸光度值），记录洗脱图，根据检测结果合并流分，浓缩、冻干。endprint

2.5 经典途径抗补体活性测定[5]

采用细胞溶血法测定抑制补体激活经典途径50%溶血所需最小供试品浓度，即CH50。

3 结果

3.1 内毒素标准品回归方程的建立

当LPS浓度范围为0.01～0.1 EU·mL-1时，回归方程为Y=0.872 9X-0.040 9，R2=0.992 8；LPS浓度范围为0.1～1.0 EU·mL-1时，回归方程为Y=6.183 1X-0.002 5，R2=0.995 3。

3.2 鱼腥草总多糖中内毒素的去除

3.2.1 凝胶过滤色谱法与亲和吸附色谱法联用将鱼腥草总多糖经Sephacryl S300柱洗脱后的洗脱液6～10管合并、透析、冻干，记为H1；将H1样品再次经AffiPrep Polymyxin柱纯化，其洗脱液的3～5管合并、透析、冻干，记为H1′，见图1。

3.2.2 疏水色谱法与亲和吸附色谱法联用将鱼腥草总多糖经Penyl Sepharose 6 FF柱洗脱后的洗脱液6～13管合并、透析、冻干，记为H2；将H2样品经AffiPrep Polymyxin柱洗脱后的3～5管合并、透析、冻干，记为H2′，见图2。

3.3 供试品干扰实验

为避免试验中各因素对鲎试剂、标准品或待测样品反应的影响，对供试品进行了干扰实验，计算回收率，并选择回收率接近100%时的供试品浓度进行供试品的内毒素含量测定。鱼腥草总多糖的质量浓度达到0.000 79 g·L-1时，回收率为接近100%；H1的质量浓度达到0.000 78 g·L-1时，回收率为接近100%；H1′的质量浓度达到0.001 25 g·L-1时，回收率为接近100%；H2的质量浓度达到0.000 85 g·L-1时，回收率为接近100%；H2′的质量浓度达到0.001 g·L-1时，回收率为接近100%，见表1。

3.4 内毒素的含量测定与抗补体活性测定

取鱼腥草总多糖及3.2项不同程度纯化样品H1， H1′， H2， H2′，根据干扰实验结果，分别配置回收率接近100%的各样品溶液，以2.4项所述方法测定其内毒素含量；取上述各样品按2.5项方法测定抗补体活性CH50。鱼腥草总多糖不同方法纯化前后的内毒素含量及抗补体活性变化结果见表2。

LPS去除率=（总多糖LPS量-纯化片段LPS量）/总多糖LPS量×100%

凝胶过滤柱Sephacryl S300对鱼腥草总多糖中的LPS几无影响，而疏水柱Penyl Sepharose与亲和吸附柱AffiPrep Polymyxin对鱼腥草总多糖中的LPS都有一定的清除效果，清除率约20%，两柱联用可达到42.85%的清除率。此外，抗补体活性结果表明，3种柱色谱纯化对鱼腥草总多糖的抗补体活性均无明显影响。

4 讨论

LPS于革兰阴性菌感染过程中起到重要作用，进入体内易引发一系列炎症及微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等严重后果。文献中已有多种方法用于药品及生物样品中LPS的去除，但由于多糖在分子量和结构上与LPS十分相近，适用于从活性多糖中选择性去除LPS的方法还很少。LPS的化学结构主要为多糖和类脂A，类脂A部分都含有多个磷酸酯基，在一定条件下呈电负性，文献报道阴离子交换层析法可去除类人胶原蛋白溶液内97.92% 的LPS，且胶原蛋白回收率可达98.01%[25]，但不适用于带负电荷的多糖样品。活性炭法与超滤法成功用于去除三七总苷溶液的LPS，去除率可达81.03%～91%[26]，但该方法同样对LPS与活性多糖无选择性。化学降解法也可用于LPS去除，但强酸、强碱或氧化剂可能会造成目标产物活性丧失，现已很少使用。王雪薇等[15]使用Triton X114萃取法去除脑膜炎球菌荚膜多糖内LPS，去除率可达85%，多糖回收率不低于80%，但适用范围有待考证。

LPS类脂A 中的胺基葡萄糖基会与某些特定的物质基团产生特异性亲和作用，因此可利用此特性来进行亲和吸附分离；疏水色谱法则使内毒素类脂A部分因疏水性而凝集，无法与层析介质结合而去除内毒素；凝胶过滤色谱则通过分子排阻原理清除内毒素[27]。本研究选用这3种柱色谱法对鱼腥草总多糖进行纯化，结果证实各方法皆不影响多糖样品的体外抗补体活性，而疏水柱色谱与亲和吸附柱色谱的联用技术清除LPS的效果明显优于凝胶过滤柱色谱与亲和吸附柱色谱的联用。本研究所用鱼腥草总多糖样品的LPS最初含量较低，如果對于实际生产中LPS混杂较严重的多糖样品，采用疏水柱色谱与亲和吸附柱色谱联用的方法纯化，很有可能达到更高的LPS清除率。因此，疏水柱色谱联合亲和吸附柱色谱用于活性多糖样品中LPS的去除有良好的应用前景，该方法对于不同植物活性多糖中LPS的清除效果也值得进一步研究验证。

[参考文献]

[1] Wu Y S，Chen Y Y，Ueng P S，et al. Effects of medicinal herbs "Plantago asiatica"， "Houttuynia cordata" and "Mentha haplocalyx" on nonspecific immune responses of cobia（Rachycentron canadum）[J]. Fish Shellfish Immun，2016，58：406.

[2] 许贵军，李志军，王琦，等. 鱼腥草的抗炎活性成分[J]. 中国药科大学学报，2016，47（3）：294.

[3] Sekita Y，Murakami K，Yumoto H，et al. Antibacterial and antiinflammatory effects of ethanol extract from Houttuynia cordata poultice[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2016，80（6）：1205.endprint

[4] Werner J. Functional mechanisms of temperature regulation，adaptation and fever：complementary system theoretical and experimental evidence[J]. Pharm Thera，1988， 37（1）：1.

[5] Jiang Y，Lu Y，Zhang J J，et al. Anticomplementary constituents of Houttuynia cordata and their targets in complement activation cascade[J]. Nat Prod Res，2014，28（6）：407.

[6] Wu M，Li H，Zhang H，et al. Development of a C3cbased ELISA method for the determination of anticomplementary potency of Bupleurum polysaccharides[J]. Acta Pharmacol Sin，2015，5（4）：316.

[7] 姚士，徐乃玉，陈道峰，等. 蓝萼香茶菜的抗补体活性成分研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（2）：199.

[8] 阮姝楠，卢燕，陈道峰. 广藿香的抗补体活性成分[J]. 中国中药杂志，2013，38（13）：2129.

[9] 张娟娟，卢燕，陈道峰. 鱼腥草抗补体活性多糖的制备工艺研究[J]. 中国中药杂志，2012，37（14）：2071.

[10] Xu Y Y，Zhang Y Y，Ou Y Y，et al. Houttuynia cordata Thunb. polysaccharides ameliorates lipopolysaccharideinduced acute lung injury in mice[J]. J Ethnopharmacol，2015，173：81.

[11] 陳道峰，姜韵，卢燕，等. 鱼腥草总多糖及其制备方法和在制药中的用途：中国，ZL201010022880.4[P].20101002.

[12] Wyns H，Plessers E，Backer P D，et al. In vivo porcine lipopolysaccharide inflammation models to study immunomodulation of drugs[J]. Vet Immunol Immunopathol，2015，166（3/4）：58.

[13] 邓仲端，瞿智玲，杨丽敏. 内毒素脂多糖诱导培养的人脐静脉内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1α[J]. 中华病理学杂志，2003，32（5）：51.

[14] 李荣芳，李晓文，王吉，等. 细菌脂多糖及其免疫应激研究进展[J]. 中兽医医药杂志，2015（4）：23.

[15] 王雪薇，王建华. Triton X114萃取法去除脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素[J]. 中国生物制品学杂志，2008，21（5）：438.

[16] 李友，龚慕辛，关怀，等. 动态浊度法比较不同方法对内毒素的清除效率[J]. 中国医院药学杂志，2010，30（14）：1175.

[17] 周康，刘康达，陈梅芳，等. 去除内毒素的研究及临床应用（一种新型亲和层析膜内毒素清除初步应用）[J]. 镇江医学院学报，1998，8（4）：465.

[18] 张顺财，朱无难，周康，等. 多粘菌素B琼脂糖层析柱清除体液中内毒素[J]. 上海医科大学学报，1992，19（1）：9.

[19] 唐守万，孔亮，欧俊杰，等. 柱亲和介质用于内毒素去除的研究[J]. 分析化学研究报告，2006，34（4）：455.

[20] 商振华，周冬梅，郭为，等. 去除内毒素的柱亲和介质与膜亲和介质的制备与特征[J]. 分析化学，1997（9）：1010.

[21] 曹春雨，刘婷，郭静，等. 显色基质法检测6种中药注射液内毒素含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：88.

[22] 李贺，张培因，卫红飞，等. 重组卡介苗热休克蛋白70的纯化及内毒素去除的效果评价[J]. 吉林大学学报：医学版，2010，36（1）：35.

[23] 王贻杰，刘勇，程海，等. 提高内毒素去除效果的质粒DNA层析纯化工艺的优化[J]. 中国生物制品学杂志，2009，22（1）：81.

[24] 郑丽君，姚勇，何国振. 利用纯化工艺去除降纤酶细菌内毒素[J]. 广东药学，1999，9（2）：29.