王枣子总黄酮影响佐剂性关节炎大鼠病理的分子机制研究

缪成贵 时维静 魏伟　秦梅颂　陈浩 张兵

[摘要] 課题组前期研究发现宿州地方特色药材王枣子中总黄酮（total flavonoids of Isodon amethystoides，TFIA）对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）具有一定的治疗作用，并且这种治疗作用可能是通过对miR152表达的上调实现的，该文进一步研究TFIA对AA大鼠病理机制影响的分子机制。采用完全弗氏佐剂制备AA大鼠，TFIA灌胃治疗，采用Realtime qPCR检测TFIA灌胃治疗对AA大鼠关节滑膜成纤维样滑膜细胞（fibroblast like synoviocytes，FLS）中miR152、甲基化酶DNMT1及甲基化结合蛋白MeCP2构成的负调控环路的影响，对miR152下游经典Wnt信号通路的影响，对AA大鼠病理基因fibronectin表达的影响。TFIA灌胃治疗显著抑制DNMT1表达，逆转了AA大鼠病理中存在的由miR152，DNMT1和MeCP2构成的负调控环路，向治疗组FLS转染miR152 inhibitors后，DNMT1表达显著恢复。TFIA灌胃治疗显著上调SFRP4表达，抑制经典Wnt信号通路关键基因βcatenin，Cmyc和ccnd1表达，显著抑制AA病理基因fibronectin表达，向治疗组FLS转染miR152 inhibitors后，逆转了TFIA灌胃治疗对SFRP4，βcatenin，Cmyc，ccnd1和fibronectin表达的影响。TFIA可能通过miR152表达的上调抑制DNMT1表达，上调SFRP4表达，抑制经典Wnt信号关节基因βcatenin，Cmyc，ccnd1表达，抑制RA基因fibronectin表达。

[关键词] 王枣子总黄酮； 佐剂性性关节炎； miR152； 成纤维样滑膜细胞； 经典Wnt信号通路

Molecular mechanism of total flavonoids in Isodon amethystoides

on adjuvant arthritis in rats

MIAO Chenggui1*， SHI Weijing1， WEI Wei1， QIN Meisong1， CHEN Hao1， ZHANG Bing2

（1. Food and Drug College， Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， China；

2. The First Affiliated Hospital， Anhui Medical University， Heifei 230032， China）

[Abstract] Our preliminary study showed that the total flavonoids in Isodon amethystoides（TFIA）， a local medicinal herb in Suzhou， had a certain therapeutic effect on adjuvant arthritis， and this therapeutic effect may be achieved through the upregulation of miR152 expression. In this paper， the molecular mechanism of TFIA on the pathogenesis of adjuvant arthritis（AA） rats was further studied. AA rats were prepared with complete Freund′s adjuvant， and then treated with TFIA by intragastric administration. Realtime qPCR was used to detect the effects of TFIA on the negative regulatory loop of miR152， methylase DNMT1 and methylCpG binding protein MeCP2 in fibroblast like synoviocytes（FLS） of AA rats， as well as the effects of TFIA on the classic Wnt signaling pathway and the expression of fibronectin gene in AA rats. Intragastric administration of TFIA significantly inhibited the expression of DNMT1 and reversed the negative regulatory loop composed of miR152， DNMT1 and MeCP2 in the pathology of AA rats. After transfection of miR152 inhibitors into the FLS in treatment group， DNMT1 expression was significantly restored. TFIA significantly upregulated the expression of SFRP4 and inhibited the expression of βcatenin， Cmyc and ccnd1， the key genes of canonical Wnt signaling pathway. TFIA also significantly inhibited the expression of fibronectin， an AA gene. The effect of TFIA on the expression of SFRP4， βcatenin， Cmyc， ccnd1 and fibronectin was reversed after transfection with miR152 inhibitors in the treatment group FLS. TFIA may inhibit the DNMT1 expression， upregulate the SFRP4 expression， inhibit the expression of classical Wnt signaling genes βcatenin， Cmyc， and ccnd1 as well as the RA gene fibronectin expression through the upregulation of miR152 expression.endprint

[Key words] total flavonoids of Isodon amethystoides； adjuvant arthritis； miR152； fibroblast like synoviocytes； canonical Wnt signal pathway

王枣子Isodon amethystoides为香茶菜属草本植物，是安徽省宿州市埇桥区当地常用的地方特色中药材，实践证明王枣子具有较好的抗炎解毒、醒酒保健等功效[12]。黄酮类成分是中草药中常见的含量较高的药效成分，课题组研究表明王枣子茎叶中含有丰富的黄酮类物质，并且王枣子中总黄酮（total flavonoids of I. amethystoides，TFIA）对RA模型大鼠佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠具有一定的治疗作用。

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性的、自身免疫性疾病，主要发病部位是人手足等小关节部位，病理变化主要包括成纤维样滑膜细胞（fibroblast like synoviocytes，FLS）异常增殖、关节软骨侵蚀、软骨不可逆的损害、关节变形等，严重的可影响关节功能，甚至造成终身残废[3]。现有的研究表明，FLS异常增殖在RA发病机制中扮演了关键角色[4]。AA大鼠病理特点与RA极为相似，是常用的RA病理和治疗研究的模型动物[5]，本课题组亦采用AA大鼠作为RA研究的模型动物探讨RA的病理机制。通过对AA大鼠病理机制的研究，課题组发现与对照相比，AA大鼠关节滑膜中miR152表达显著降低，同时DNMT1和MeCP2表达显著升高。AA大鼠病理中存在着miR152过表达抑制DNMT1表达，高表达的DNMT1和MeCP2协同抑制miR152表达的双向负调控环路。过表达的miR152通过抑制DNMT1表达抑制经典Wnt信号通路活性，进而抑制AA大鼠病理发展[67]。

RA发病年龄有年轻化的趋势，RA病因仍然未能完全阐明[8]，积极探讨中药在RA病理中的作用及分子机制对RA的预防和治疗有重要的积极意义。课题组前期研究结果显示，经TFIA灌胃治疗后，TFIA灌胃治疗能显著抑制AA大鼠足爪肿胀度，显著抑制IL1表达，显著抑制AA大鼠FLS增殖活力。与对照组相比，AA组FLS中miR152表达显著降低，过表达的miR152显著抑制IL1表达，抑制FLS增殖。TFIA对AA大鼠足爪肿胀具有一定的抑制作用，并且这种抑制作用可能是通过miR152表达的调控实现的。本文课题组以AA大鼠为研究模型，采用Realtime qPCR等方法检测TFIA灌胃治疗对AA大鼠FLS中miR152，DNMT1及MeCP2构成的负调控环路的影响，对miR152下游经典Wnt信号通路的影响，对AA大鼠病理基因fibronectin表达的影响，探讨TFIA治疗RA的分子机制。

1 材料

TFIA：取王枣子干燥茎叶，充分烘干并粉碎。使用95%乙醇提取并减压浓缩，浓缩物再用水溶解，然后调pH至2.0，最后乙醚萃取，得到的有机相精制浓缩备用。经测定TFIA质量分数>85%；逆转录试剂盒（美国Fermentas）；miR152引物（德国Qiagen）；miR152 inhibitors及NSmiRNA（上海吉玛）；QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒（德国Qiagen公司）；脂质体LipofectamineTM 2000，OptiMEM（美国Invitrogen公司）；新生胎牛血清（美国Hyclone）。

2 方法

2.1 AA大鼠制备 雄性SD大鼠购自安徽医科大学实验动物中心（皖医实动准字第01号），体质量160～180 g，适用性饲养4 d后随机分组，即空白对照组、AA组、TFIA 100 mg·kg-1给药治疗组、给药阴性对照组、转染组、转染阴性对照组等，每组大鼠10只。空白对照组采用足跖底部注射方法注射0.1 mL生理盐水，其余各组足跖底部注射完全弗氏佐剂0.1 mL制备AA大鼠。

2.2 AA大鼠关节炎评分 采用常规的大鼠关节炎评分方法评价AA大鼠是否制备成功。具体如下：大鼠鼻子出现红肿或结节评为1分，尾巴出现红肿或结节评为1分，1只耳朵出现红肿或结节评为1分，1只足爪出现症状评为1分。每只大鼠最高得分8分。

2.3 大鼠滑膜FLS原代培养 采用组织块方法培养FLS。SD大鼠注射完全弗氏佐剂后第4天给药治疗，第28天处死动物，无菌条件下分离大鼠膝关节滑膜组织，小剪刀剪碎成1～3 cm3大小滑膜组织块。长玻璃吸管转移组织块进入无菌一次性细胞培养瓶内，贴壁摆放整齐，每瓶细胞加入3 mL含胎牛血清的DMEM细胞培养基，置细胞培养箱内反扣培养7 h，使细胞贴壁紧密，然后反正培养6 d，每隔3 d更换1次细胞培养基。然后弃净瓶内培养基，每瓶细胞加胰酶0.5 mL消化细胞0.5 min，使用移液器充分吹打贴壁细胞制备细胞悬液，按1∶2比例传达培养，本试验所用细胞为传代3～5代FLS。

2.4 miR152 inhibitors细胞转染 在FLS传代3～5代内，待FLS铺满细胞培养瓶瓶壁90%以上，细胞长势良好时，弃净瓶内培养基，加生理盐水3 mL洗涤2次，然后加胰酶0.5 mL消化细胞0.5 min。使用移液器无菌条件下充分吹打制备1×105 个/mL的FLS悬液，接种FLS于6孔板内，细胞密度适中，然后置细胞培养箱内5% CO2，37 ℃条件培养至FLS铺满细胞培养瓶瓶壁75%左右用于细胞转染。采用lipofetaminTM 2000转染试剂向各组FLS转染miR152 inhibitors及阴性对照序列NSmiRNA，转染步骤参照转染试剂盒提供的方法。

2.5 Realtime qPCR检测 Trizol试剂常规提取各试验组FLS的总RNA，参照Fermentas试剂盒提供的逆转录步骤逆转录各组试验大鼠FLS的cDNA。Realtime qPCR引物购自德国Qiagen公司，参照Qiagen公司试剂盒提供的定量扩增步骤，采用Realtime qPCR方法检测各靶基因在不同样本中的表达。扩增条件为95 ℃ 15 min，然后94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共扩增40个循环。endprint

2.6 统计学分析 数据分析采用SPSS 17.0软件，所有数据结果均以±s表示，组间比较采用OneWay ANOVA检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 TFIA灌胃治疗对DNMT1表达的影响 课题组前期研究发现，与对照相比，AA大鼠关节滑膜中miR152表达显著降低，DNA甲基化酶DNMT1和甲基化结合蛋白MeCP2表达显著升高，过表达的miR152抑制DNMT1表达，并且过表达的DNMT1和MeCP2反过来能协同抑制miR152表达，过表达的miR152通过抑制DNMT1表达抑制经典Wnt信号通路活性，进而抑制AA大鼠病理发展。同时，课题组前期研究发现TFIA灌胃治疗能够显著恢复AA大鼠滑膜中miR152的表达，鉴于miR152与DNMT1，MeCP2之間的相互调控关系，TFIA灌胃治疗是否会对DNA甲基化酶DNMT1的表达产生影响？课题组分离各试验组AA大鼠滑膜组织，培养FLS，采用Realtime qPCR检测TFIA灌胃治疗对DNMT1表达的影响。结果显示TFIA灌胃治疗后，与AA大鼠组相比，治疗组的DNMT1表达均值由1.508 1降低至1.309 2，显著降低。向治疗组AA大鼠FLS转染miR152 inhibitors后，DNMT1表达均值由1升高至1.208 6，又显著升高，提示TFIA通过对miR152表达上调抑制了DNMT1表达，见图1。

3.2 TFIA灌胃治疗对经典Wnt信号通路上游负调控因子SFRP4表达的影响 SFRP4是经典Wnt信号通路上游负调控因子，课题组前期研究发现SFRP4在AA发病过程中发生了甲基化修饰致使其表达显著降低。课题组采用Realtime qPCR检测TFIA灌胃治疗对SFRP4表达的影响，结果发现，与AA组相比，治疗组FLS中SFRP4表达均值由0.710 8升高至0.838 2，显著升高。向治疗组AA大鼠FLS转染miR152 inhibitors后，SFRP4表达由1降低至0.881 4，又显著降低，提示TFIA可能通过对miR152，DNMT1表达的调控影响了SFRP4表达，见图2。

3.3 TFIA灌胃治疗对经典Wnt信号通路表达的影响 课题组前期研究发现经典Wnt信号通路在AA发病过程被激活了，及信号通路关键基因βcatenin，Cmyc，ccnd1表达都显著上调。课题组采用Realtime qPCR检测TFIA灌胃治疗对经典Wnt信号通路的影响，结果发现，与对照相比，TFIA灌胃治疗后经典Wnt信号通路活性降低，即βcatenin表达均值由1.907 2降低至1.710 9，Cmyc表达均值由1.415 5降低至1.200，8，ccnd1表达均值由1.682 2降低至1.308 5，都显著被抑制。向治疗组AA大鼠FLS转染miR152 inhibitors后，βcatenin表达均值由1升高至1.150 7，Cmyc表达均值由1升高至1.161 3，ccnd1表达均值由1升高至1.090 6，都显著升高了。结合前期研究结果，TFIA可能是通过对miR152，DNMT1表达的调控影响了经典Wnt信号通路活性，见图3。

3.4 TFIA灌胃治疗对AA病理基因fibronectin表达的影响 fibronectin是AA大鼠及RA疾病发生的标志性基因，课题组前期研究发现AA病理基因fibronectin在AA发病过程显著高表达。课题组采用Realtime qPCR检测TFIA灌胃治疗对fibronectin表达的影响，结果发现，与AA组相比，治疗组fibronectin均值由1.507 3降低至1.310 9，显著降低。向治疗组AA大鼠FLS转染miR152 inhibitors后，fibronectin由1上调至1.106 6，显著升高，见图4。提示TFIA影响了AA大鼠的发病机制，并且这种影响是通过对miR152，DNMT1及经典Wnt信号通路的影响实现的。

4 讨论

王枣子主要用于治疗清热解毒、腹泻等，具有较好的抗菌消炎、调节免疫力等作用，为宿州市埇桥区当地群众广泛使用的地方特色药材。经鉴定，王枣子属于唇形科香茶菜属草本植物，并且在安徽、江苏、湖北等地都有分布。现代药理研究王枣子中齐墩果酸含量丰富，并且有降血糖、降血脂、强心、抗心律失常等功效[910]。鉴于草本植物中含有丰富的黄酮类成分[11]，本课题组从王枣子中总黄酮作为切入点，研究王枣子总黄酮TFIA对RA的作用。前期研究显示TFIA具有一定的治疗RA模型动物AA大鼠的作用，并且这种治疗作用可能是通过对AA大鼠滑膜细胞FLS中miR152表达的调控实现的。本文采用完全弗氏佐剂制备AA大鼠，组织块方法培养FLS，研究TFIA通过对miR152的调控对miR152下游其他靶基因及相关的信号通路，特别是经典Wnt信号通路的影响，探讨TFIA治疗AA的分子机制。

本课题组前期研究发现，在AA大鼠病理机制中存在着低表达的miR152受DNA甲基化酶DNMT1和甲基化结合蛋白MeCP2共同抑制，过表达的miR152能够抑制DNMT1表达的双向负调控环路，并且过表达的miR152通过对DNMT1的抑制上调经典Wnt信号通路上游负调控因子SFRP4表达，进而抑制经典Wnt信号通路的开放、抑制AA病理基因fibronectin的表达[68]。

本课题组前期发现TFIA灌胃治疗AA大鼠后恢复了miR152的表达，因此本课题组预测TFIA可以通过对miR152表达的上调影响DNMT1、经典Wnt信号及fibronectin的表达。本文采用细胞培养、Realtime qPCR等研究方法研究TFIA通过对miR152的调控对miR152下游其他靶基因及相关的信号通路，结果发现，AA大鼠灌胃治疗显著抑制DNA甲基化酶DNMT1表达，逆转了AA大鼠病理中存在的由miR152和DNMT1和MeCP2构成的负调控环路。向治疗组FLS转染miR152 inhibitors后，DNMT1表达显著恢复，即TFIA通过对miR152的上调达到抑制DNMT1的作用。AA大鼠灌胃治疗显著上调SFRP4表达，抑制经典Wnt信号通路关键基因βcatenin，Cmyc和ccnd1的表达，显著抑制AA病理基因fibronectin的表达。向治疗组FLS转染miR152 inhibitors后，逆转了灌胃治疗对SFRP4和fibronectin的表达，逆转了对经典Wnt信号通路的影响。本文研究结果提示TFIA灌胃起到的治疗AA作用可能是通过对miR152，DNMT1及MeCP2构成的负调控环路及经典Wnt信号通路的影响实现的。endprint

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[责任编辑 张宁宁]endprint