红外光谱法快速预测不同种类重楼中重楼皂苷含量

吴喆　张霁　张金渝　徐福荣　王元忠

[摘要] 重樓皂苷是中药重楼主要的有效成分，为了快速评价重楼品质，保证重楼在临床治疗中的疗效，本文采用红外光谱结合偏最小二乘回归法（partial least squares regression，PLSR）对重楼中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ进行定量分析，建立快速评价重楼品质的方法。采集78份不同产区、不同种类重楼样品的红外光谱，用高效液相色谱测定重楼样品中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ及重楼皂苷Ⅶ的含量，将重楼的红外光谱数据和液相数据进行拟合，快速预测3种重楼皂苷含量。原始红外光谱经多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、标准正态变量（standard normal variate，SNV）、正交信号校正（orthogonal signal correction，OSC）、一阶求导（first derivative，1st Der）、二阶求导（second derivative，2nd Der）预处理后，运用偏最小二乘回归分析建立重楼皂苷的定量预测模型。重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的最佳预处理方法为MSC+OSC+2nd Der，重楼皂苷Ⅶ的最佳预处理方法为MSC+SNV+OSC+2nd Der；重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ 3个指标成分定量校正模型的决定系数（R2）分别为0.930 8，0.934 8，0.912 3 mg·g-1；校正均方根误差（root mean square error of estimation，RMSEE）分别为1.855 0，0.632 3，0.001 6 mg·g-1；验证模型的决定系数（R2）分别为0.948 8，0.963 6，0.780 1 mg·g-1；预测均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP）分别为1.704 6，1.227 7，0.001 9 mg·g-1；定量模型的预测值与真实值比较接近，模型预测效果好，其中重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ定量模型效果优于重楼皂苷Ⅶ。该方法无损、快速、准确，可用于重楼中重楼皂苷含量的快速测定。

[关键词] 重楼； 红外光谱； 定量分析； 重楼皂苷； 偏最小二乘回归

Rapid prediction of the content of polyphyllin in various species of

Paris by infrared spectrometry

WU Zhe1，2， ZHANG Ji2， ZHANG Jinyu2， XU Furong1*， WANG Yuanzhong2*

（1. College of Traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China；

2. Institute of Medicinal Plants， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650200， China）

[Abstract] Polyphyllin is the main active constituent in Paris which was a traditional Chinese medicine. In order to evaluate the quality of Paris rapidly and ensure the efficacy in clinical therapy， we quantified the contents of polyphyllin Ⅰ， polyphyllin Ⅱ and polyphyllin Ⅶ using infrared spectroscopy with partial least squares regression（PLSR）. The method for evaluating the quality of Paris was established. Infrared spectra of 78 samples from various species in different origins were collected. The contents of polyphyllin Ⅰ， Ⅱ and Ⅶ were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）. The HPLC data were combined with the spectral data to predict the contents of three polyphyllin rapidly. Multiplicative signal correction（MSC）， standard normal variate（SNV）， orthogonal signal correction（OSC）， first derivative and second derivative were utilized for the spectral preprocessing. Then， the optimized spectral data were used to establish the quantitative prediction model based on PLSR. The results showed that the best spectral pretreatment of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ were MSC+OSC+2nd Der and that of polyphyllin Ⅶ was MSC+SNV+OSC+2nd Der. In the quantitative calibration model， the determination coefficients （R2） of polyphyllin Ⅰ， polyphyllin Ⅱ and polyphyllin Ⅶ were 0.930 8， 0.934 8 and 0.912 3， respectively while the Root mean square error of estimation（RMSEE） were 1.855 0， 0.632 3 and 0.001 6 mg·g-1， respectively. In the verification model， the R2 of polyphyllin Ⅰ， polyphyllin Ⅱ and polyphyllin Ⅶ were 0.948 8， 0.703 6 and 0.801 7， respectively， and the root mean square error of prediction（RMSEP）were 1.704 6， 1.227 8 and 0.002 0 mg·g-1， respectively. Because of the predictive value of quantitative model was closed to the real value， the effect of the model was good. The model of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ were better than that of polyphyllin Ⅶ. The developed method was nondestructive， fast， and accurate. It was feasible to determine the content of polyphyllin in Paris.endprint

[Key words] Paris； infrared spectroscopy； quantitative analysis； polyphyllin； partial least squares regression

优质的中药材是保证中药在临床疗效中安全性和有效性的前提，中药质量控制与评价是保证中药的安全性和有效性的重要手段[1]。中药的质量决定着现代中医药的发展，对其进行质量控制及品质评价是目前中医药研究的热点[2]，因此寻找科学、有效、全面和实用的中药质量控制与评价方法是亟需解决的难题。

在中药质量评价领域，有效成分的含量检测主要用高效液相色谱法和气相色谱法，以上方法均存在样品前处理复杂、耗时长、仪器操作繁琐等缺陷。中药有效成分在检测的过程中，不稳定的化合物易通过光照、受热、受潮等发生一系列的光解、氧化或水解反应，使化合物内部结构发生改变，故前处理复杂及分析时间长易导致检测准确度降低[3]。近年来，红外光谱定量分析技术因其操作简单、快速、无损等优势在食品[45]、农业[6]、化工[7]以及医学[89]领域迅速发展。此外，在中药质量评价方面也得到了廣泛的应用，如采用近红外光谱法结合偏最小二乘回归建立了定量模型，对人参中总皂苷含量进行预测，结果显示，近红外光谱法结合化学计量学可为人参质量控制提供一种新方法[10]；Shao等[11]采用红外光谱结合高效液相法建立了白术中白术内酯Ⅰ，白术内酯Ⅲ的偏最小二乘定量校正模型，交叉验证显示模型预测效果好；雷敬卫等[12]以枳实中辛弗林、醇提物的高效液相色谱法和热浸法所测含量作为参考值，运用近红外光谱技术结合化学计量学方法建立枳实中辛弗林及醇提物的定量分析模型，并用未知样品进行验证，结果显示该方法准确、简便、快速，可用于枳实中辛弗林和醇浸出物含量的快速预测。

重楼为百合科植物云南重楼Prais polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.Mazz.或七叶一枝花P. polyphylla Smith var. chinensis（Franch.）Hara的干燥根茎，秋季采挖，除去须根。重楼作为云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片的主要原料药之一，已广泛应用于临床治疗[13]。2015年版《中国药典》对重楼的质量控制已做出明确规定，按干燥品计算，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅳ的总量不少于0.60%[14]。由于重楼皂苷含量的高低直接影响重楼药材的质量，评价其含量对药用植物重楼具有重要意义。本文采用傅立叶红外光谱结合偏最小二乘回归建立了药用植物重楼中3种皂苷的定量分析模型，为重楼药材的皂苷含量测定提供了一种新方法，同时为快速评价重楼品质提供参考和依据。

1 材料

78份重楼药材由云南省农业科学院药用植物研究所张金渝研究员鉴定为百合科植物白花重楼、云南重楼、多叶重楼、凌云重楼、毛重楼、南重楼、七叶一枝花、球药隔重楼、五指莲、西畴重楼、狭叶重楼、长药隔重楼的干燥根茎，样品来源详见表1。样品粉碎后，过80目筛，置于自封袋中备用。

Frontier型傅立叶变换红外光谱仪（Perkin Elmer， USA）；LCMS8030型超高效液相色谱仪（Shimadzu， Japan）；XS125A型电子分析天平（Precisa，Switzerland）；FW100型高速粉碎机（华鑫仪器厂）；80目标准筛盘（道墟五四仪器厂）。

对照品重楼皂苷Ⅰ（批号14010711）、重楼皂苷Ⅱ（批号14022211）、重楼皂苷Ⅵ（批号14011203）、重楼皂苷Ⅶ（批号14011203）购自中国食品药品检定研究院，甲醇（色谱纯，美国Fisher试剂公司），乙腈（色谱纯，美国Fisher试剂公司），甲酸（分析纯，天津市风船化学试剂三厂），水为自制超纯水。

2 方法

2.1 红外光谱的采集

取1.5 mg样品与100.0 mg溴化钾在玛瑙研钵中充分混合研磨后加入模具压成均匀薄片，采集样品红外光谱图。实验条件：光谱扫描范围4 000～400 cm-1，扫描信号累加16次，分辨率为4 cm-1，每个样品扫描2次，取平均光谱，扫描时扣除H2O和CO2的背景。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ各1.0 mg，分别加入甲醇充分溶解，定容至10 mL量瓶中，摇匀，避光，4 ℃保存备用。

2.2.2 供试品溶液 精密称取重楼粉末约0.1 g，置具塞试管中，加80%甲醇2 mL，常温下超声提取40 min，冷却至室温，即得备用。

2.3 色谱条件

根据2015年版《中国药典》一部中重楼皂苷高效液相色谱检测方法改良后进行测定。色谱条件：Shimpack XRODS Ⅲ column（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）0.05%甲酸水（B），柱温为45 ℃，进样量为1 μL。梯度洗脱0～1.5 min，17%A；1.5～4.0 min，17%～23%A；4.0～8.7 min， 23%A；8.7～18 min， 23%～38%A；18～25.6 min，38%～60%A；25.6～28.2 min，60%～17%A；

平衡4 min后进行下一次进样。不同种类重楼色谱图，见图1。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围 精密吸取重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ对照品溶液，加入甲醇配制系列浓度的对照品溶液，按照2.3项色谱法进行测定。以峰面积Y为纵坐标，对照品溶液质量浓度X（g·L-1）为横坐标，分别建立标准曲线，并计算回归方程，见表2。

2.4.2 精密度试验 精密吸取重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ对照品溶液，按2.3项色谱条件下，连续进样6次，持续3 d。记录重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的保留时间和峰面积，计算RSD。结果见表3，保留时间的日内和日间RSD均低于2%，峰面积的日内和日间RSD均低于3.2%，表明方法的精密度好。endprint

2.4.3 重复性试验 取同一云南重楼样品粉末0.1 g，按2.2项方法制备供试品溶液，依照2.3项色谱条件进样测定，记录重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的保留时间和峰面积。计算保留时间RSD分别为0.20%，0.11%，0.14%和0.12%，计算峰面积RSD分别为2.1%，2.3%，3.1%，1.1%，表明方法重复性好。

2.4.4 稳定性试验 取同一云南重楼供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定。记录重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的保留时间和峰面积，计算保留时间RSD分别为0.070%，0.070%，0.030%，0.030%，计算峰面积RSD分别为1.6%，2.3%，2.3%，3.7%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加标回收率试验 精密称取9份云南重楼样品各0.1 g，分别按80%，100%，120%加入重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的标准品溶液，计算加标回收率，结果见表4。

2.5 重楼皂苷定量模型

78个重楼样品的原始谱图经预处理后，随机抽取15个作为验证集，其余样品作为训练集，结合偏最小二乘回归分析（partial least squares regression，PLSR）建立重楼皂苷的定量分析模型。评价模型的主要参数为决定系数（determination coefficient，R2）、校正均方根误差（root mean square error of estimation，RMSEE）[15]和预测均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP）[1617]。其中，R2越接近1，RMSEE和RMSEP值越小，表明定量模型的预测值与高效液相色谱色谱法所测真实值的相关性越强，模型的预测精确度越高[18]。

3 讨论与结论

3.1 重楼红外光谱

78份重楼样品的原始红外叠加光谱图中，其峰位和峰形基本一致，但吸光度间存在明显差异。3 399，2 930，1 640，1 372，1 153，1 079，1 023，928，577 cm-1为重楼样品主要特征吸收峰，见图2。3 500～2 500 cm-1处特征吸收峰主要归属于羟基（OH）伸縮振动和烷基中（CH）对称伸缩振动，3 399，2 930 cm-1分别为OH的振动吸收峰和亚甲基（CH2）的对称伸缩振动。1 640 cm-1为甾体皂苷中羰基（C=O）的伸缩振动或多糖中OH的弯曲振动。1 372 cm-1为甲基（CH3）对称弯曲振动[19]。1 200～950 cm-1处特征吸收峰主要为皂苷和淀粉等糖类物质的振动吸收区域[20]，1 153，1 079，1 023，928 cm-1强吸收峰为皂苷类、淀粉和糖苷类（CO）伸缩振动或甾体皂苷中（OH）弯曲振动。1 153，1 079，1 023，577 cm-1主要为多糖（COC）的伸缩振动[20]。

3.2 光谱预处理

实验过程中，物质的干扰、化学因素、实验仪器的缺陷都可能产生噪音，样品表面的色泽、背景颜色和其他因素常会导致光谱出现明显基线漂移。噪音过大会降低光谱的信噪比、分辨率、准确度和精密度[21]。在对光谱进行分析前，往往利用光谱预处理消除原始谱图信号基线漂移、光散射等各种干扰和噪音的影响。光谱预处理还能够将光谱中包含的有效信息充分提取，从而达到提高校正模型预测精确度的目的。多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）用于消除不同样品表面颗粒大小或颗粒分布不均产生的散射影响，从而消除因散射而导致基线偏移和偏移的现象[2223]。光谱求导处理可以解决基线漂移的影响，有效区分重叠的谱带并将细微的差异放大，提高光谱的分辨率和灵敏度从而达到净化图谱的作用[24]。正交信号校正（orthogonal signal correction， OSC）是在建模之前，将光谱阵与浓度阵进行正交处理，滤除两者不相关的正交主成分，再进行定量分析[2526]。OSC能够通过剔除与目标变量无关的干扰信息提高光谱分析的准确度。标准正态变量（standard normal variate，SNV）可以计算指定光谱总变量的标准偏差，利用该标准偏差值将所有光谱标准化，从而达到消除斜率变化和校正光散射影响[27]。

本文利用SIMCAP+11.5软件对原始光谱图进行一阶求导（first derivative，1st Der）、二阶求导（second derivative，2nd Der）、MSC、OSC和SNV等预处理。重楼皂苷Ⅰ的最佳预处理方法为MSC+OSC+2nd Der，提取前3个主成分时累计贡献率达到了93%；重楼皂苷Ⅱ的最佳预处理方法为MSC+OSC+2nd Der，提取前8个主成分时累计贡献率达到了93%；重楼皂苷Ⅶ的最佳预处理方法为MSC+SNV+OSC+2nd Der，提取前5个主成份时累计贡献率达到91%，见表5。

3.3 重楼皂苷HPLC测定

不同种类重楼样品中重楼皂苷含量，药用植物重楼中重楼皂苷的含量存在较大差异，其中五指莲含重楼皂苷Ⅰ最高为（18.854±5.578） mg·g-1，但含重楼皂苷Ⅶ含量较低仅为（0.001±0.001） mg·g-1；狭叶重楼含重楼皂苷Ⅶ最高为（0.015±0.003） mg·g-1，而重楼皂苷Ⅱ未检出；含重楼皂苷Ⅱ最高的是长药隔重楼达到6.118 mg·g-1，见表6。在HPLC色谱法测定含量过程中，60份样品中重楼皂苷Ⅵ的含量值均未检出，故重楼皂苷Ⅵ在以下分析中不再做进一步研究。

3.4 重楼皂苷预测模型的建立及验证

原始红外光谱存在大范围的谱带重叠现象，仅从图谱中难以获知重楼皂苷含量与吸光度之间的关系。化学计量学方法可以有效的解决谱带重叠的现象[28]，并可作为红外光谱图与重楼中指标性成分含量的桥梁，通过化学计量学方法将光谱数据转换为定量模型，便能够通过光谱信息预测出重楼中指标性成分的含量[29]。PLSR为最常用的定量分析多元校正法，能够克服数据共线，谱带重叠、噪音等问题[30]。PLSR基于双线性多变量关系将X矩阵（红外光谱数据）和Y矩阵（HPLC测定值）相关联[3133]，并最大化X与Y矩阵间的协方差，利用新的潜在变量解释X矩阵的可变性，同时根据Y与X矩阵间的线性关系对Y矩阵进行解释[34]。endprint

重楼样品红外原始光谱数据经预处理后，随机抽取15份样品为验证集，其余63份样品为训练集。将训练集样品的红外光谱数据与高效液相色谱法检测的皂苷含量值相结合，分别建立重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ的PLSR定量回归模型， 见图3。结果显示，训练集样品均匀的分布在回归线两侧。通过最佳光谱预处理后，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ的R2分别为0.930 8将15份验证集样品的红外光谱数据导入所建的定量模型，对验证集样品进行定量预测，从而验证模型的准确性。重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ的R2分别为0.948 8， 0.963 6， 0.781 0；RMSEP分别为1.704 6， 1.227 7， 0.001 9 mg·g-1，重楼样品中各重楼皂苷的真实值与预测值相关图， 见图2。重楼样品中各指标成分含量的红外光谱预测值与HPLC法测定的真实值相关性好，利用红外光谱建模预测重楼中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ以及重楼皂苷Ⅶ含量是可行的。与重楼皂苷Ⅰ， Ⅱ的验证模型相比，重樓皂苷Ⅶ的模型预测效果更低，这可能是样品中重楼皂苷Ⅶ的含量较低，导致训练模型和验证模型的相关性较低[35]。

4 结论

重楼中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ是目前评价重楼品质的主要依据。本文利用偏最小二乘回归将红外光谱和高效液相色谱数据进行拟合，建立了重楼中主要指标成分的PLSR模型。红外光谱经MSC+OSC+2nd Der处理后，重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ模型的预测效果最佳；红外光谱经MSC+SNV+OSC+2nd Der处理后，重楼皂苷Ⅶ的预测效果最佳；重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ的PLSR模型效果优于重楼皂苷Ⅶ。本研究的重楼样品来自不同的产区且种类丰富，故利用其红外光谱所建立的PLSR模型具有代表性。利用红外光谱分析技术结合PLSR建立重楼主要指标成分的定量分析模型，该方法弥补了传统含量检测方法耗时、费力等缺陷，可用来快速、准确评价药用植物重楼的质量。

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[责任编辑 丁广治]endprint