决明子萘并吡喃酮类对照提取物研究及其在决明子药材质量控制中的应用

周德勇　骆宜　苏磊　姜艳艳　刘斌

[摘要] 建立以决明子萘并吡喃酮类对照提取物为对照的决明子药材质量控制方法，探讨对照提取物在中药质量控制中应用的可行性。采用色谱分离技术制备决明子萘并吡喃酮类对照提取物，以决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷及决明子苷C对照品为对照，对决明子萘并吡喃酮类对照提取物进行标定。以已知含量的对照提取物为对照，建立决明子药材HPLC含量测定方法，并与以对照品为对照的含量测定结果进行比较，结果表明，2种含量测定方法无显著差异。该结果为决明子萘并吡喃酮类对照提取物在决明子药材质量控制中的应用提供科学依据，为中药对照提取物替代单一对照品进行中药质量控制奠定基础，为中药质量控制提供新的研究思路和模式。

[关键词] 决明子； 对照提取物； 萘并吡喃酮； 质量控制； 应用

Study on naphthopyrone reference extract and application on

assay of Semen Cassiae

ZHOU Deyong1， LUO Yi1， SU Lei1， JIANG Yanyan1，2*， LIU Bin1*

（1. School of Chinese Pharmacy， Beijng University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Quality Control Technology and Engineering Center of Chinese Medicine， Beijing Municipal

Commission of Education， Beijing 100102， China）

[Abstract] A quality control method of Semen Cassiae was established by using naphthopyrone reference extract（NRE）. Meanwhile， the feasibility about NRE replacing single component reference in quality control of traditional Chinese medicine was explored. After NRE of Semen Cassiae being prepared by chromatographic separation technology， we determined the three main components， cassiaside B2， rubrofusarin6OβDgentiobioside and cassiaside C. In the meantime， an HPLC analytical method， based on the NRE as standard substance， was developed to determinate the contents of three main components in Semen Cassiae. Ttest was used for comparison of the determination results of the two methods（single chemical component and NRE as reference substances， respectively）， and the Ttest result demonstrated that there was no significant difference between the two methods. The results developed scientific basis for the application of NRE of Semen Cassia in the quality control， which could be applied for the quality control of traditional Chinese medicine using reference extract substituting single chemical reference， and provide a new research model for the quality control of Chinese medicine.

[Key words] Semen Cassiae； standard reference extract； naphthopyrone； quality control； application

中藥质量控制与评价是中药研究领域的重要科学问题，现行中药质量控制方法主要以单一化学成分为对照品，从定性和定量角度对中药及复方进行质量控制。这种以单一化学成分表征中药整体质量的模式无法真正控制和评价中药质量，与中医药整体观亦不相符，在一定程度上阻碍了中药现代化、国际化的进程。中药成分的复杂性决定了以单一成分或指标成分为对照难以客观评价中药质量，然而，多指标成分的质量评价模式却受到中药化学对照品分离难度大、单体稳定性差或实验成本高等因素的制约[1]。针对这一问题，有研究者[23]提出了一测多评法，该方法可在一定程度上解决中药多成分同时定量的一些问题，但同时该方法在相对校正因子的定量、指标成分的色谱峰定性，尤其是方法的适用性和耐用性方面尚存在一些问题。因此，建立符合中药多成分特点的新方法是解决中药质量控制问题的有效途径。

中药对照提取物是指主要化学成分及其含量明确、稳定性好、纯度较高的中药提取物，其化学成分组分比例相对固定，指标性成分含量已采用相应的对照品进行标定，可以实现同时对多个组分进行定性和定量分析，不但制备方法相对简单、成本较低，而且后续质量控制过程相对简洁、实验步骤相对简便，用于中药材多成分分析，可节约资源，降低检验成本[4]。如2015年版《中国药典》收载了银杏叶片剂2 种可供选择使用的含量测定方法，若使用化学对照品进行含量测定，则需使用槲皮素、山柰素、异鼠李素等7种化学对照品，若使用已标定的2种银杏叶对照提取物进行含量测定，成本将大大降低，同时可以减少单体对照品的使用，减少实验步骤和实验成本[5]。因此，中药对照提取物的研发与应用不仅可以解决中药质量控制中成本高、稳定性差、重现性差等诸多问题[68]，而且为更科学、合理、系统的开展中药质量控制，提供新的研究方法和研究模式。endprint

决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明C. tora L.的干燥成熟种子，具有清肝明目、润肠通便的功效，临床多用于治疗目赤涩痛、头痛眩晕、目暗不明、大便秘结等[9]。决明子中主要含有蒽醌类化合物和萘并吡喃酮类化合物[1012]，此外，还含有多糖、蛋白质、脂肪酸以及多种微量元素。2015年版《中国药典》以大黄酚和橙黄决明素为指标对其进行质量控制，然而，蒽醌类化合物并非决明子中专属性化学成分，且含量较低，因而，以其为对照品进行质量控制，难以全面、科学的反映决明子药材质量[5]。文献及前期研究结果表明，萘并吡喃酮類化合物在决明子药材中的含量明显高于蒽醌类成分，且具有保肝、降血脂等作用[1314]，是决明子中的重要药效物质基础。因此，制备决明子萘并吡喃酮类对照提取物[15]，并以其为对照物质，建立基于萘并吡喃酮类对照提取物的含量测定方法，能够明确对照提取物在决明子质量控制中的适用性和可行性，提升决明子药材质量控制方法的科学性和专属性，解决萘并吡喃酮类成分决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷及决明子苷C对照品稀缺、价格昂贵等问题，同时为建立科学合理的决明子药材质量标准奠定基础。

1 材料

SHBⅢ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；KQ500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Waters高效液相色谱仪，包括1525型二元高压梯度泵系统，2998型DAD检测器，2414型柱温控制系统，2707型自动进样系统，Breeze色谱工作站（美国Waters公司）；Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Sartorious BT 25S型1/10万电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher公司）；屈臣氏纯净水；其他试剂均为分析纯。

对照品决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷及决明子苷C均为自制，经1H，13CNMR鉴定结构，HPLC检测，峰面积归一化法计算，纯度均大于98%。

决明子药材均购于北京同仁堂，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为决明C. obtusifolia的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 决明子萘并吡喃酮类对照提取物的研究

2.1.1 对照提取物制备

决明子药材，10倍量30%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，水分散，AB8型大孔树脂纯化，依次用水、20%乙醇、50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱部位，回收溶剂，蒸干后，得到决明子半制备组分Ⅰ。将半制备组分Ⅰ与硅胶（3∶5）均匀拌样，于80 ℃ 真空干燥，以拌样硅胶与空白硅胶1∶13干法上样，氯仿甲醇水（6.5∶3.5∶0.6）洗脱，洗脱完成后将干柱分成20部位，合并2～7，11～17硅胶，加甲醇洗脱，回收溶剂，蒸干后，得到决明子半制备组分Ⅱ。将半制备组分Ⅱ通过ODS柱纯化，以甲醇乙腈（2∶1）混合溶液为A相，以水为B相进行梯度洗脱，洗脱程序为30% A（2倍柱体积）， 33% A（1倍柱体积）， 36% A（1倍柱体积）， 39% A（1倍柱体积）， 42% A（1倍柱体积）， 45% A（1倍柱体积），通过薄层色谱法检识，合并含有指标成分的洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得决明子萘并吡喃酮类对照提取物。

2.1.2 对照提取物标定

以决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C对照品为对照，测定决明子萘并吡喃酮类对照提取物中3个指标成分的含量。

2.1.2.1 色谱条件 色谱柱SunFire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇乙腈（2∶1）混合溶液（A）水（B）梯度洗脱（0～35 min， 31% A；35～45 min，31%～37% A；45～50 min，37%～42% A）；流速1 mL·min-1；检测波长278 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。在此色谱条件下，混合对照品和对照提取物色谱图见图1。

2.1.2.2 对照品溶液配制 精密称取决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C对照品适量，分别制得每1 mL含0.053 52 mg决明子苷B2，0.079 56 mg红镰霉素6OβD龙胆二糖苷，0.069 84 mg决明子苷C的混合对照品溶液，再用纯甲醇稀释成一系列不同浓度的混合对照品溶液。

2.1.2.3 供试品溶液配制 精密称取决明子萘并吡喃酮类对照提取物3.00 mg，置于25 mL量瓶中，加30%甲醇超声溶解，静置，定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2.4 线性关系考察 取2.1.2.2项的不同浓度混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 μL注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。以对照品进样量（X）为横坐标，色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得出回归方程，结果见表1。

2.1.2.5 精密度考察 取2.1.2.3项决明子供试品溶液，每次吸取10 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，以决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C色谱峰峰面积计算RSD，结果分别为0.54%， 0.72%， 0.61%，表明仪器精密度良好。

2.1.2.6 稳定性试验 取2.1.2.3项决明子供试品溶液，分别于制备后0， 2， 4， 6， 8， 12， 24 h进样，测定决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C色谱峰峰面积，计算RSD分别为0.96%， 1.1%， 0.98%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.1.2.7 重复性试验 分别精密称定决明子萘并吡喃酮类对照提取物6份，按2.1.2.3项方法制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C的RSD，结果分别为1.2%， 1.1%， 1.2%，表明该方法重复性良好。endprint

2.1.2.8 加样回收率试验 分别精密称定决明子萘并吡喃酮类对照提取物6份，加入一定量的对照品溶液，按2.1.2.3项方法制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积，并计算3个指标成分的加样回收率及RSD。结果决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C的加样回收率分别为98.36%，102.8%，100.8%，RSD分别为1.7%，1.3%，1.5%。

2.1.2.9 对照提取物标定 取3批自制决明子萘并吡喃酮类对照提取物，精密称定，按2.1.2.3项制备样品溶液，测定并计算各样品中3个指标性成分的含量，结果3个成分的总含量均高于60%，3批对照提取物含量标定结果见表2。

2.1.3 对照提取物稳定性考察

采用2.1.2.1项的HPLC含量测定方法，考察决明子萘并吡喃酮类对照提取物的稳定性。对照提取物经制备后，常温避光保存，进行6个月稳定性实验，分别于第0， 1， 2， 3， 6个月抽样检测，分析样品中决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C含量，结果见表3，3个指标性成分的RSD分别为0.24%，0.25%，0.15%，均小于1%，表明决明子萘并吡喃酮类对照提取物在6个月内具有良好的稳定性。

2.2 对照提取物在决明子药材质量控制中的应用

以决明子萘并吡喃酮类对照提取物为对照，测定决明子药材中决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷及决明子苷C等3个成分的含量，并与单体对照品测得的结果进行比较，考察对照提取物用于药材质量控制的科学性和可行性。

2.2.1 色谱条件

采用2.1.2.1项条件，对照提取物和供试品色谱图见图2。

2.2.2 对照提取物溶液制备

精密称取已标定含量的决明子萘并吡喃酮类对照提取物6.12 mg，置10 mL量瓶中，加30%甲醇超声溶解，静置，摇匀，30%甲醇稀释至刻度，制得每1 mL含0.122 0 mg决明子苷B2，0.131 5 mg红镰霉素6OβD龙胆二糖苷，0.147 3 mg决明子苷C的母液。精密吸取母液1 mL，转移至10 mL量瓶中，加30%甲醇稀释，定容，摇匀，制成每1 mL含0.012 20 mg决明子苷B2，0.013 15 mg红镰霉素6OβD龙胆二糖苷，0.014 73 mg决明子苷C的对照提取物溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

取决明子药材粉末（20目）60 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声处理（100 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察 精密吸取2.2.2项不同体积的决明子萘并吡喃酮类对照提取物溶液，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。以对照品进样量（X）为横坐标，色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得出回归方程，见表4。

2.2.4.2 精密度考察 取决明子药材粉末（20目）60 mg，精密称定，按2.2.3项制得供试品溶液，连续进样六次，每次10 μL，以色谱峰峰面积计算RSD，见表5。

2.2.4.3 稳定性考察 取2.2.3项决明子供试品溶液，分别于制备后0，2，4，6，8，12，24，48，72 h进样，测定决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C色谱峰峰面积计算RSD，见表5。

2.2.4.4 重复性考察 取同一批决明子粉末（20目）6份，每份60 mg，精密称定，按2.2.3项方法制备供试品溶液，测定色谱峰峰面积，并计算RSD，见表5。

2.2.4.5 加样回收率考察 取已知含量的决明子药材粉末（20目）（决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C的量分别为0.394 1%，0.317 9%，0.629 8%）6份，每份30 mg，精密称定，分别置于25 mL具塞锥形瓶中，精密加入2.2.2项决明子萘并吡喃酮类对照提取物母液1 mL，按2.2.3项方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。计算决明子苷B2、红镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C苷回收率及RSD，见表6，RSD均小于3.0%，表明该方法回收率良好。

2.2.5 决明子药材含量测定

取20批决明子药材粉末（20目），精密称定，按2.2.3项制备供试品溶液，分别以决明子萘并吡喃酮类对照提取物和单体对照品为对照，测定决明子苷B2、紅镰霉素6OβD龙胆二糖苷、决明子苷C的含量。采用配对t检验法比较决明子2种含量测定方法结果间的差异性，2种方法之间无显著性差异，表明对照提取物法与对照品法所得测定结果具有一致性。因此，决明子萘并吡喃酮类对照提取物可有效替代单体对照品进行决明子质量评价，见表7。

3 小结与讨论

随着对中药研究的深入和发展，中药质量控制研究已不再满足于仅仅达到定量准确这一基本要求，建立多指标成分同步分析的模式已经成为中药质量控制的重要发展方向，研究和开发中药对照提取物正是顺应了这一发展趋势。对照提取物具有相对固定的化学组成，其定量指标与原药材的量化关系明确，专属性较强，同时具有安全、稳定的理化特性，适用于建立多指标评价体系。因此，中药对照提取物将在中药质量评价中获得广阔的应用前景。

目前决明子及其一系列相关制品的质量控制主要是通过水解蒽醌苷，测定其水解产物大黄酚及橙黄决明素的含量来实现质量控制，不能反映其真实情况。本文在前期对决明子萘并吡喃酮类对照提取物制备方法研究基础上，制备出含量明确的对照提取物，建立了基于萘并吡喃酮类对照提取物的决明子药材含量测定方法，并分别采用对照提取物法和对照品法对决明子药材进行分析测定，结果显示对照提取物可替代单体对照品实现对决明子药材的科学质量控制，该质量控制模式更符合中药多成分的特色，同时使中药质量控制更合理、系统、简便。本研究为决明子萘并吡喃酮类对照提取物进一步应用于含有决明子复方制剂的质量控制奠定了坚实的基础，为中药质量控制新模式的建立提供科学依据。endprint

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[责任编辑 丁广治]endprint