1株海绵共生真菌代谢产物的研究

龙海林　李康强　　许文东　　傅玉萍

[摘要] 综合运用各种色谱分离技术对海绵共生真菌Emericella variecolor的固体大米培养基发酵产物进行化学成分研究，利用各种波谱技术进行化学结构鉴定。结果从该真菌的发酵产物中分离得到6个单体化合物，分别鉴定为 （+）2acetyldihydroterrein （1），（+）3acetyldihydroterrein（2），anditomin（3），andilesin A（4），andilesin C（5），andilesin B（6）。其中化合物1和2为新化合物。

[关键词] 海绵共生真菌； Emericella variecolor； 化学成分

Study on metabolites from a spongederived fungus

LONG Hailin， LI Kangqiang， XU Wendong， FU Yuping*

（National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of Traditional Chinese Medicine，

Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangzhou 510240， China）

[Abstract] We have carried out the investigation on a spongederived fungus，which was identified as Emericella variecolor from the south sea of China. Two new chemical constituents，（+）2acetyldihydroterrein （1） and （+）3acetyldihydroterrein （2），with four known compounds，anditomin （3），andilesin A （4），andilesin C （5） and andilesin B （6），were isolated from this fungus by column chromatography over silica gel， Sephadex LH20， and ODS. The structures of 1 and 2 were elucidated by spectroscopic methods including NMR，HRESIMS，and CD.

[Key words] spongederived fungus； Emericella variecolor； chemical constituents

海洋真菌兼具种属多样、分布广、代谢途经复杂的特性。据统计，已知约71.2万种海洋真菌可栖身诸如水体、底泥、砂石等无机质生境，也可共附生于如藻类、无脊椎动物、鱼类等活体[1]。海绵共生真菌所处的生态环境兼具陆地生态系统无法比拟的高压、高盐、低光照和寡营养的物理胁迫，也存在与其宿主长期协同进化过程中生物选择胁迫，这种胁迫使两者之间发生很多次基因重组或改变[2]，其互扰性和易扰性直接影响它们的次生代谢[34]。迄今为止，国内外学者已从海洋动植物共生真菌中发现一些活性分子，有些具有罕见的结构，如从海绵共附生真菌Penicillium terrestre中发现的胆碱酯酶抑制剂sorbiterrin A[5]，以及从海绵共附生细菌Ruegeria sp.中发现的新颖抗菌环肽类成分[6]等。国内外学者早在二十世纪六七十年代就已经开始对真菌Emericella variecolor进行化学成分研究，发现了多种类型的化合物，如酮类[7]、萜类[89]、多烯吡喃酮類[10]、苯甲醇类[11]等。为了获得更多的活性化合物，本实验采用大米固体培养基进行微生物发酵，在正常室温条件下培养海绵共生真菌Emericella variecolor 30 d，再用乙酸乙酯萃取大米培养基，之后对提取物进行化学成分分离。在提取物中分离得到6个单体化合物，其中化合物1和2为新化合物，其他4个为已知化合物（图1）。

1 材料

UV谱用JASCO V550 紫外可见分光光度仪测定；旋光值用Autopol Ⅲ automatic polarimeter型旋光仪测定；HRESIMS用Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL型质谱仪测定；NMR用Bruker AvanceⅢ 400 MHz核磁共振仪测定；分析型HPLC用Shimadzu LC20AD 液相色谱仪测定，检测器为SPDM20A；半制备使用Alltech LabAlliance Series Ⅲ仪器，配备UV检测器。

硅胶薄层分析使用青岛海洋化工厂的GF254薄层预制板；柱色谱硅胶（200～300目）为青岛海洋化工厂产品；常压反相ODS柱色谱使用的C18填料为日本YMC公司产品；凝胶柱色谱Sephadex LH20使用的是Pharmacia公司产品；分析用HPLC色谱柱为Thermo Scientific BDS Hypersil的C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；半制备柱为Waters SunfireTM C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）；所有试剂为分析纯或色谱纯。

实验用菌种E. variecolor分离自中国南海采集到的海绵，菌种保藏于北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室。

2 提取与分离

菌株E. variecolor在经过30 d大米培养基发酵后，将大米发酵物充分破碎，用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩后得到粗提物20 g，粗提物用80%甲醇混悬后用石油醚萃取3次，减压回收甲醇水部位得到粗浸膏约10 g。粗浸膏首先用常压ODS柱色谱分离，洗脱剂为30%，40%，50%，60%，70%甲醇梯度洗脱，得到5个流分（Fr.1～Fr.5）。Fr.3（5.2 g）再次进行硅胶 （200～300目，300 g） 柱色谱，以CH2Cl2CH3OH（100∶1，50∶1，30∶1，15∶1，10∶1）梯度洗脱，相同组分合并，得到6个流分（Fr.3.1～Fr.3.6），其中Fr.3.3为化合物3（1.8 g），Fr.3.5为化合物4（1.6 g），Fr.3.1（0.5 g）再经半制备液相 [CH3CNH2O（70∶30）] 色谱分离，得到化合物1（8 mg）和2（10 mg），Fr.3.4（180 mg）和Fr.3.6（160 mg）分别用半制备液相 [CH3CNH2O（70∶30）] 色谱纯化，分别得到化合物5（52 mg）和化合物6（48 mg）。endprint

3 結构鉴定

化合物1 为白色粉末；[α]20D+ 40.1（c 1.15，MeOH）；高分辨电喷雾质谱（HRESIMS）显示其准分子离子峰为m/z 221.079 5 [M+Na]+（计算值 C10H14O4Na，221.079 0），说明其相对分子质量为198，分子式为C10H14O4，不饱和度为4；首先，分析1HNMR图谱，该化合物的氢谱与化合物dihydroterrein[12]非常相似，只多了1个甲基信号δH 2.11（3H，s，H10），可能为乙酰基的甲基，根据13CNMR和HMBC图谱发现，H10与羰基碳（C9）有相关信号，可确定化合物中含有1个乙酰基，HMBC图谱中，H2[δH 5.00（d，J=3.0 Hz）]与C9有相关信号，可确定乙酰基通过氧原子与C2相连（表1）；化合物1的相对构型可根据H2与H3的偶合常数J=3.0 Hz来确定，可知H2与H3处于反式，绝对构型通过比较计算ECD与实测ECD来确定，C2与C3分别为R和S构型，命名为（+）2acetyldihydroterrein（图2）。

4 讨论

21世纪前，海绵一直是发现海洋天然产物的最主要生物来源[1620]，发现了许多化学结构新颖，生物活性显著、作用机制独特的功能小分子，其中的一些已经作为新药候选先导化合物，处于临床前或临床研究阶段；海绵共生真菌作为海绵宿主的重要组成部分，两者互相协作，共同适应海洋复杂的生存环境，海绵为真菌提供营养物质和寄生产所，共生真菌为海绵抵御外来环境的威胁而释放一些化学物质；海绵共生真菌体内蕴藏着巨大的生物合成基因簇，大力挖掘海绵共生真菌的天然产物合成潜力，是获得活性化学成分的又一宝贵途径，总之，海绵及其共生微生物是开发先导化合物的重要资源。

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[責任编辑 丁广治]endprint