内皮细胞提取和UHPLCLTQOrbitrap法分析筛选苦碟子注射液中的活性成分

刘思燚　张红柱　范菁　尚展鹏　王菲　李玮婕　刘颖　卢建秋　张加余

[摘要] 应用细胞生物色谱法及UHPLCLTQOrbitrap质谱联用技术快速筛选鉴定苦碟子注射液中可能的活性成分。选择人脐静脉内皮细胞（huma umbilical vein endothelid cells，HUVEC）作为靶细胞，先使苦碟子注射液中的活性成分与靶细胞特异性结合，经细胞靶点脱敏失活后，应用LCMS快速鉴定与细胞靶向亲和的化学成分，从而筛选得到苦碟子注射液中可能的活性成分。根据获得的精确相对分子质量数据、保留时间以及结合苦碟子注射液中的化学成分进行鉴定归属。最终，从细胞裂解液中共筛选鉴定出9个化学成分，其中包括倍半萜内酯类成分4个、有机酸类成分3个以及黄酮类成分2个。应用细胞生物色谱法与UHPLCLTQOrbitrap质谱联用技术快速筛选鉴定苦碟子注射液中可能的活性成分，可为苦碟子注射液药效物质基础研究提供一种快捷、有效的方法学借鉴。

[关键词] 苦碟子注射液； 人脐静脉内皮细胞； 细胞生物色谱法； 液质联用技术

HUVECs extraction and UHPLC LTQ Orbitrap analysis for screening

vascular endothelium protective components in Kudiezi injection

LIU Siyi1，2， ZHANG Hongzhu3， FAN Jing4， SHANG Zhanpeng1， WANG Fei1，

LI Weijie1， LIU Ying1， LU Jianqiu1*， ZHANG Jiayu1*

（1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. Center for Drug Evaluation， China Food and Drug Administration， Beijing 100038， China；

3. The First Hospital of Fangshan District， Beijing 102400， China； 4. WuXi AppTec， Shanghai 200131， China）

[Abstract] An effective method has been employed as a tool for screening active components in Kudiezi injection by using cell chromatography and sensitive UHPLCHRMSn method. The potential bioactive components in Kudiezi injection could be selectively bound to the HUVECs target cells first. After cell target desensitization and inactivation， the chemical constituents with cell target affinity were identified by LCMS， so as to screen the possible active components in Kudiezi injection. Based on the accurate mass measurements and the retention time， in total， 9 compounds were tentatively identified and characterized， including 4 sesquiterpene lactones， 3 phenolic acids and 2 flavonoids. HUVECs biospecific extraction coupled with UHPLCLTQOrbitrap analysis could provide a rapid and efficient method for the identification of potential bioactive components in Kudiezi injection， and provide the reference for further research on its effective materials basis.

[Key words] Kudiezi injection； HUVECs； cell chromatography； UHPLC LTQ orbitrap

苦碟子为菊科苦荬菜属植物抱茎苦荬菜Ixerissonchifolia （Bunge） Hance的全草，具有清热解毒、排毒止痛等功效[1]。苦碟子注射液为抱茎苦荬菜提取精制而成的静脉注射液，具有抗血小板凝聚、降血脂、改善微循环、抗肿瘤等作用，主要用于治疗心绞痛、脑梗死、冠心病等病症，临床上已广泛应用于心脑血管疾病[23]。然而，苦碟子注射液药效物质基础仍有待进一步研究[46]。随着中药现代化进程的发展，明确中药中的药效活性物质，成为系统研究和梳理的重点[7]。

现代药理研究发现，药物可与细胞膜上的受体、通道、酶等特异性结合或进入细胞内部是药物发挥作用的一个重要原因[89]。细胞生物色谱法便是基于此理论发展而来的一种新兴生物色谱技术。其通过药物可与靶点结合的原理，将效应物质进行靶向富集分离，进而应用于中药药效物质基础的筛选鉴定和作用机理研究[1011]。基于此，本文应用细胞生物色谱法联合液质联用技术对临床常用中藥苦碟子注射液中可能的活性成分进行筛选鉴定：先使苦碟子注射液与人脐静脉内皮细胞（huma umbilical vein endothelid cells，HUVEC）进行特异性结合，通过缓冲液洗掉未被细胞特异性结合的成分，而后使细胞靶点失活并将被结合的化学成分从细胞中释放，应用UHPLCLTQOrbitrap技术将该解离液按色谱条件进行色谱分析，以期对苦碟子注射液中可能的活性成分进行快速筛选鉴定，以及为药效成分不明确中药的药效物质研究提供快捷有效的方法。endprint

1 材料

Accela超高效液相色谱仪与LTQOrbitrap XL质譜，配有电喷雾离子源（ESI），Xcalibur 2.1 工作站（美国Thermo Scientific公司）；R200D电子分析天平（1/10万，德国Sartorius 公司）；Millipore Synergy UV型超纯水机（美国Millipore 公司）；KQ250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；8000系列水套二氧化碳培养箱（美国Thermo scientific公司）；YJCJIFD 双人单面超净台（吴江市净化设备总厂）；细胞计数板（中国化工仪器厂）；细胞培养瓶（美国Corning公司）；CK40F200倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；超声细胞破碎仪（美国BIORAD公司）。

苦碟子注射液（规格10 mL/支，批号141209，吉林通化药业有限公司）；乙腈和甲醇（质谱级，德国Merck公司），甲酸（色谱级，德国Merck公司），DMEM培养基（美国Corning公司）；胎牛血清（美国Corning公司）；胰蛋白酶（美国HyClone公司）；PBS磷酸缓冲液（美国Corning公司）；青霉素、链霉素混合溶液（美国HyClone公司）。

人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）（北京北纳创联生物技术研究院）。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 10%培养基 取青霉素链霉素溶液200 μL，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）5 mL，补足DMEM培养基（Dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM）至50 mL，4 ℃保存备用。

2.1.2 药液处理 取苦碟子注射液以0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 细胞培养

细胞复苏后，用含200 μL青霉素链霉素溶液、10%FBS的DMEM培养基接种于细胞培养瓶中，于37 ℃，5%CO2空气饱和湿度培养箱中培养。细胞每2 d更换1次培养基，当生长至80%时，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，以1∶2传代培养。

2.3 苦碟子注射液与HUVECs特异性结合

①将HUVECs培养在含10%FBS的DMEM培养基中，当细胞密度达到90%时，倒掉培养液。加入无血清的DMEM溶液，在37 ℃，5%CO2的条件下孵育0.5 h，倒掉无血清的DMEM溶液，加入上述配制好的药品。②在37 ℃，5%CO2的条件下孵化1 h后，倒掉药液，用2 mL PBS冲洗细胞7次。取1 mL最后一次洗脱液与乙腈溶液按照1∶10比例混溶，涡旋2 min，1万r·min-1离心10 min，取上清液备用。③细胞经过-80 ℃反复冻融3次，加10 mL乙醇超声破碎，将裂解液减压挥干，用0.5 mL超纯水溶解，1万r·min-1离心10 min，取上清液备用。将最后一次洗脱液和细胞裂解液进行LTQOrbitrap检测分析。④以同样的方法用无血清的DMEM溶液代替药液作空白细胞的裂解液。

2.4 液质分析方法的建立

2.4.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UHPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸水溶液（A）乙腈（B）；梯度洗脱（0～10 min，2%～10%B；25～30 min，20%～30%B；40～43 min，45%B；44～47 min，90%B；48～51 min，2%B）；流速0.25 mL·min-1；进样量3 μL。

2.4.2 质谱条件 负离子检测模式，毛细管温度350 ℃，辅助气流速10 arp，鞘气流速30 arp，毛细管电压-35 V，喷雾电压3 kV，管透镜电压-110 V。样品采用傅里叶变换（Fourier transform，FT）进行全扫描（full scan，FS）和母离子列表（parent ion list，PIL）扫描，扫描范围m/z 100～1 200，隔离宽度2，分辨率为3万；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描（data dependent scan，DDS），选取上一级丰度最高的3个峰进行碰撞诱导解离（collision induced dissociation，CID）碎片扫描，激活时间30 ms，CID激活单位0.25 q，归一化碰撞能量为35%。

3 结果

3.1 空白对照组

空白的HUVECs细胞裂解液的总离子色谱图（TIC）见图1A，总离子流图中未检测到苦碟子注射液中的化学成分。同时，细胞的第7次洗脱液中未检测到苦碟子注射液中的化学成分，见图1B，说明第7次的洗涤已经把物理吸附细胞膜上的成分清洗干净，在加药的细胞裂解液中的成分应为与细胞膜有相互作用的成分。

3.2 苦碟子注射液化学成分在HUVECs中的吸收

在样品吸收后HUVECs细胞裂解液的提取离子流图（EIC）见图2A。用提取离子流的方法结合苦碟子注射液整体化学成分分析、相关参考文献数据以及根据UHPLCESIMS检测得到细胞裂解液中各化学成分的精确相对分子质量数据、保留时间对其中的成分进行鉴定归属。最终，从细胞裂解液中共筛选鉴定出9个化学成分，其中包括机酸类成分3个、倍半萜内酯类成分4个以及黄酮类成分2个，见图2，表1。

在加药的细胞裂解液中所检测到的苦碟子注射液中的成分均未在加药细胞的最后一次洗脱液和空白对照组中检测到，应为细胞有吸收的成分。在HUVECs细胞裂解液中鉴定出奎宁酸、绿原酸、隐绿原酸、异鼠李素O槐糖苷、ixeriside A、木犀草素7OβD葡萄糖醛酸苷、3OβDglucopyranosyl8βhydroxyguauan10（14）ene6，12olide、11，13αdihydroixerin Z及11βhydroxyleucodin11Oβglucopyranoside等9种苦碟子注射液中的化学成分，这些成分可能为苦碟子注射液中的活性成分。所鉴定化合物结构见图3。endprint

3.3 与细胞靶向亲和的化学成分相关药理研究

引起脑缺血性疾病的重要因素之一是由自由基的增加引起的脂质过氧化作用，从而导致细胞和神经元损伤。因此，治疗脑缺血性疾病不仅需要改善缺血区血流从而恢复供氧和需氧平衡，而且还应清除毒性氧自由基[12]。Heilmann等[12]通过实验证明，隐绿原酸具有很强的捕获超氧阴离子和羟自由基的能力。另有实验研究发现双咖啡酰奎宁酸及其衍生物具有抗氧化作用，并用动物模型证实了双咖啡酰奎宁酸及其衍生物对血管内皮损伤具有抑制作用[13]。

核转录因子κB（nuclear factorkappa B，NFκB）是一种重要的核内转录因子。研究表明，NFκB在有细胞因子、炎性因子等参与的脑组织缺血、缺氧损伤过程中起着极为重要的作用，通常处于非激活状态。当急性脑缺血时，血管内皮细胞、胶质细胞及神经元中NFκB便会被激活[14]。Christina Akesson等[15]通过实验证明，奎宁酸可显著抑制脾细胞内NFκB的活性并明显升高损伤脾细胞的存活率。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD 活性的高低间接反映脑缺血脑细胞的损害程度。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPX）是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶，它可以非酶促反应的形式直接与氧自由基结合，达到清除氧自由基的目的，也可作为GSHPX 催化反应中的底物，起到清除氧自由基的作用。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是氧自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化作用的终产物，其含量可直接反映机体内脂质过氧化程度，并间接反映氧自由基对细胞的损伤程度。相关研究表明，木犀草素7OβD葡萄糖醛酸苷能够降低血清中MDA的含量，增强血清SOD及GSHPX的活力。从而对脑缺血具有一定的保护作用，起到抗脑缺血损伤的作用[16]。关于异鼠李素O槐糖苷药理研究的报道不多。

到目前为止，共从苦碟子中分离得到近50个倍半萜内酯类化合物[1]，但是对其药理活性研究较少。陈曦[17]对旋覆花中2种倍半萜内酯类成分的抗炎作用及其机制进行研究，结果表明，实验中2种倍半萜内酯类成分可抑制核因子κB 抑制蛋白（IκB）的磷酸化及降解，继而抑制了NFκB p65的核转移。故而，推测部分倍半萜内酯类化合物可通过抑制NFκB活性从而影响血管损伤的发展。本实验从活性追踪出发，筛选出ixeriside A、3OβDglucopyranosyl8βhydroxyguauan10（14）ene6，12olide、11，13αdihydroixerin Z、11βhydroxyleucodin11Oβglucopyranoside等候选活性成分，可使后续研究有目的地对苦碟子注射液中倍半萜内酯类成分进行分离，为倍半萜内酯类化合物的活性研究提供一个简便快捷的途径，从而为倍半萜内酯类化合物的进一步开发奠定基础。

通过查阅相关文献，苦碟子注射液可通过多途径、多靶点对HUVECs发挥作用，如提高一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性、下调小窝蛋白1（caveolin1，Cav1）的表达、抑制NFκB信号通路、下调PKCδ/MARCKS信号转导通路等，从而起到对内皮细胞的保护作用[1819]。

4 讨论

传统中药有效成分的筛选往往是先将中药混合物的各化学组分分离提纯，再确定其化学特性，最后才是确定其活性与毒性等，致使中药研究速度缓慢，耗时耗力且在分离工作上存在较多盲目性。目前，越来越多的研究者从活性追踪出发，先确定活性成分，再进行系统分离，这不仅可节省大量的人力、物力，还可以有目标地富集分离需要的化合物，是研究中药药效物质基础的新思路。细胞生物色谱法便是基于此理论发展而来的一种新兴生物色谱技术，在中药化学成分研究方面具有其他方法不可比拟的优势，成为中药及复方活性成分的分离、筛选、鉴定一体化的强有力的分析工具[2021]。

目前，文献报道已从苦碟子药材中分离出黄酮类、有机酸类、倍半萜内酯类、腺苷等成分，较为全面地揭示了其含有的固有成分，并对苦碟子注射液中的主要成分进行了含量测定，为本研究的开展奠定了坚实的基础[47]。同时，有学者对苦碟子注射液中總黄酮和总有机酸2 类成分进行研究，表明总黄酮及总有机酸化合物对大鼠急性心肌缺血有明显保护作用。并推测有机酸类化合物及黄酮类化合物是苦碟子注射液治疗心脑血管疾病的活性物质[2223]。然而对苦碟子注射液中倍半萜内酯类成分研究较少，对该注射液中各类活性单体化合物的活性研究也较为匮乏。因此，本研究应用细胞生物色谱法联合液质联用色谱仪快速筛选和鉴定苦碟子注射液中可能的活性成分。根据获得的精确相对分子质量数据、保留时间以及结合苦碟子注射液中的成分鉴定结果对特异性结合的化学成分进行鉴定归属。最终，在细胞裂解液中共筛选鉴定出9个苦碟子注射液中的化学成分，其中包括倍半萜内酯类成分4个、有机酸类成分3个及黄酮类成分2个。另外，通过查阅相关文献：与细胞靶向亲和的化学成分极有可能具有一定的药理活性。证实了本文建立的筛选中药中药效成分的方法稳定可靠，可为苦碟子注射液药效物质基础研究提供科学依据，同时此方法也可应用于其他中药的药效成分的筛选，为中药复杂体系物质基础研究提供参考。

[参考文献]

[1] 蔡伟. 苦碟子倍半萜内酯类似物靶向分离及体内代谢研究[D]. 北京：北京中医药大学， 2015.

[2] 刘颖， 王青， 王放， 等. 苦碟子注射液HPLC指纹图谱与化学模式识别分析[J]. 中国药学杂志， 2013， 48（24）：2097.

[3] 王放， 张加余， 王青， 等. HPLCHRMSn法鉴定苦碟子注射液中酚酸类成分[J]. 中南药学， 2013， 11（8）：561.endprint

[4] 刘思燚， 张秀平， 尚展鹏， 等. UHPLCLTQOrbitrap鉴定苦碟子注射液化学成分及其在大鼠血浆中的移行成分[J]. 中国中药杂志， 2016， 41（12）：2235.

[5] Wang F， Zhang J Y， Yin P H， et al. Rapid identification of polyphenols in Kudiezi injection with a practical technique of mass defect filter based on highperformance liquid chromatography coupled with linear ion trap/orbitrap mass spectrometry[J]. Anal Methods， 2014， 6（10）：3515.

[6] Cai W， Zhang J Y， Liu Y， et al. Metabolic profiles of 11， 13αdihydroixerin Z in rats using high performance liquid chromatographyLTQorbitrap mass spectrometry[J]. Anal Methods， 2016， 8（4）：854.

[7] 刘颖， 卢建秋， 张加余， 等. 苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLCESIMSn分析[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（16）：2675.

[8] Li S L， Li P， Sheng L H， et al. Live cell extraction and HPLCMS analysis for predicting bioactive components of traditional Chinese medicines[J]. J Pharm Biomed Anal， 2006， 41（2）：576.

[9] Li F， Tan Y S， Chen H L， et al. Identification of schisandrin as a vascular endothelium protective component in YiQiFuMai powder injection using HUVECs binding and HPLCDADQTOFMS/MS analysis[J]. J Pharmacol Sci， 2015， 129（1）：1.

[10] Hong M， Wang X Z， Wang L， et al. Screening of immunomodulatory components in Yupingfengsan using splenocyte binding and HPLC[J]. J Pharm Biomed Anal， 2011， 54（1）：87.

[11] 岳宣峰. 基于HUVECM和色譜质谱联用的药物筛选模型的建立及其应用[D]. 西安：陕西师范大学， 2009.

[12] Heilmann J， Merfort I， Weiss M. Radical scavenger activity of different 3， 4dihydroxyf lavonols and 1， 5dicaffeoylquinic acid studied by inhibition of chemiluminescence[J]. Planta Med， 1995， 61（5）：435.

[13] Hatano T， Yauhara T， Yoshihara R， et al. Effects of interaction of tannis with coexisting substances：inhibitory effects of tannins and related polyphenols on xanthine oxidase[J]. Chem Pharm Bull， 1990， 38（5）：1224.

[14] Cornicelli J A， Trivedi B K. 15Lipoxygenase and its inhibition：a novel therapeutic target for vascular disease[J]. Curr Pharm Des， 1999， 5（1）：11.

[15] Akesson C， Lindgren H， Pero R W， et al. Quinic acid is a biologically active component of the uncariatomentosa extract CMed 100[J]. Int Immunopharmacol， 2005， 5（1）：219.

[16] 于玲玲， 王学东， 王淞林，等. 木犀草素7OβD葡萄糖醛酸苷治疗脑梗塞的用途：中国，CN 102327281A[P]. 20120125.

[17] 陈曦. 旋覆花中倍半萜内酯类成分的抗炎作用及其机制研究[D]. 天津：天津医科大学， 2016.

[18] 于佳澜. 苦碟子对缺氧损伤血管内皮细胞的保护作用及PKCδ/MARCKS通路的调节[D].北京：北京中医药大学， 2013.

[19] 刘亚琼， 朱陵群， 张允岭， 等. 苦碟子注射液对人脑微血管内皮细胞高糖损伤后核因子κB及黏附分子表达的影响[J]. 中华中医药杂志， 2010， 25（2）：204.

[20] Zheng Z G， Duan T T， He B， et al. Macrophage biospecific extraction and HPLCESIMSn analysis for screening immunological active components in Smilacis Glabrae Rhizoma[J]. J Pharm Biomed Anal， 2013， 77（2）：44.

[21] 闵春艳. 茵陈蒿汤人肝细胞膜固相色谱研究[D]. 南京：南京中医药大学， 2004.

[22] 陈英红， 罗浩铭， 王颖， 等. 苦碟子注射液不同活性组分对大鼠脑神经细胞保护作用的实验研究[J]. 中国中医药科技， 2016， 23（4）：421.

[23] 罗浩铭. 苦碟子注射液中有效物质基础的研究[D]. 长春：吉林大学， 2010.

[责任编辑 孔晶晶]endprint