杜仲松脂醇二葡萄糖苷的体内合成、分布、积累与提取纯化研究进展

刘 倩，肖深根，陈阳峰，谭洁莹，李师阳

（湖南农业大学园艺园林学院，长沙410128）

杜仲松脂醇二葡萄糖苷的体内合成、分布、积累与提取纯化研究进展

刘 倩，肖深根*，陈阳峰，谭洁莹，李师阳

（湖南农业大学园艺园林学院，长沙410128）

综述了松脂醇二葡萄糖苷合成、分布、积累以及提取纯化等方面的研究进展，以期为提高杜仲原药用部位松脂醇二葡萄糖苷含量及扩大药源提供参考，达到杜仲资源高效、全面、综合利用的目的。

杜仲；松脂醇二葡萄糖苷；合成；分布；积累；提取纯化

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我国特有的一种孑遗经济落叶乔木，含丰富天然活性物质，这些物质广泛分布在杜仲各个器官中。松脂醇二葡萄糖苷［（+）-1-pinoresinol 4，4′-di-O-β-D-glucopyranoside］是杜仲中一类以一些初生代谢产物为“原料”，经一系列酶催化而形成的杜仲非生长所必需的小分子有机化合物，对杜仲在复杂环境中生存、适应和发展起着重要作用。

松脂醇二葡萄糖苷（Pinoresinol Diglucoside，PDG）属双环氧木脂素类，由2个四氢呋喃型木脂素（tetrahydrofuran）中脂肪烃链上的羟基缩合以顺式相骈而形成［1］。结构中含4个手性碳，属顺式结构，遇酸后易发生异构化，从而改变其旋光活性。PDG分子式为C32H42O16，分子量682.66628，熔点为225～227℃；PDG含糖基，因而易溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，在丙酮或三氯甲烷中溶解，不溶于氯仿、乙醚及石油醚；呈白色或类白色粉末或结晶性粉末，无臭［2］。PDG的分子结构式如图1。

图1 PDG结构式图［3］

《中国药典》2015年版中将PDG含量作为杜仲药材质量控制指标，其作为杜仲皮的关键功能成分，能调节骨代谢、减轻脑缺血—再灌注损伤等［4，5］，而最受关注的在于它是杜仲中发挥降压作用的主要药效成分，具有双向调节血压这一特殊功效。目前研究发现其存在3种可能的降压机制，认为主要是通过诱导血管内皮产生舒血管物质，从而发挥舒张血管作用来实现降压［6］。生产上，PDG主要从多年生长的杜仲干皮中获得。尽管后期发展起来的杜仲环剥皮再生技术一定程度上实现了杜仲资源的可持续利用，但也需4～5年的生长周期才能进行二次剥皮。由于原材料的限制，提取所得的PDG远不能满足医药事业迅速发展的需求。笔者综述了杜仲PDG体内生物合成、分布、积累及提取纯化几个方面的研究成果，以期为扩大杜仲药用部位选择范围及提高原药用部位PDG含量提供参考，达到杜仲资源高效、全面、综合利用的目的。

1 杜仲PDG体内生物合成途径

当前的研究成果已基本建立起PDG体内生物合成的结构，大致分为3个阶段：1）杜仲中葡萄糖类物质转化形成苯丙氨酸，再经苯丙烷途径合成一种活性木脂素的前体物质—松伯醇（coniferyl alco-hol）［7］。2）2分子松柏醇单体经松脂醇合酶催化，通过严格的立体特异性选择聚合生成1分子松脂醇（pinoresinol）［8］。该反应是木脂素生物合成的限速步骤，促使木脂素单体代谢流趋向木脂素的生源合成方向，由此进入木脂素代谢途径，但反应涉及的酶体系还未完全鉴定出来［9］。3）松脂醇在酶的作用下发生特定的糖基化修饰生成PDG，在植物细胞和组织中积累贮存［10］。但其糖基化途径相关代谢酶类并不清楚，需要再进一步探索。

2 杜仲PDG体内分布

PDG是杜仲在适应环境过程中与环境应力（生物的和非生物的）相互作用的结果，存在生育期差异和部位差异，本身及前体合成呈区域化分布［11］。杜仲不同部位、不同采收期各成分分布有明显差异，就PDG而言，各部位分布并不均匀。王丽楠等［12，13］测定出杜仲不同部位PDG含量：内皮＞栓皮＞枝＞叶，另于4月至9月6个时间点分别对杜仲干皮、枝、叶PDG含量进行考察，发现干皮中PDG含量在5、6月较高，叶中4月较高。杨林军等［14］采用RPHPLC法也测得杜仲干皮中PDG含量大于枝皮，与前人研究结果相符，为传统上以干皮入药提供了科学依据。由于PDG形成及储藏位点都严格地限制在杜仲一定的发育期或特殊器官中［11］，但目前所涉及到的研究部位还不够全面，可以考虑实行对杜仲更多部位一整年不同生育期PDG含量的动态监测，以更好地探索PDG分布规律。

3 杜仲PDG积累

PDG是杜仲中一种特殊植保素，其积累与杜仲遗传基因、发育程度等有关，环境刺激也能通过影响杜仲体内生物合成基因表达而控制PDG积累。目前阐述环境条件诱导次生代谢产物积累机制假说有多种，存在较多争议，较为被接受的几种假说之间也有部分观点存在差异，甚至彼此矛盾，但普遍认为一定程度的环境胁迫有利于植株体内次生代谢产物量的积累和释放［15］。冯锁民等［16］报道了杜仲首次环剥皮的再生皮中PDG含量略高于原生皮，推测是受伤刺激加快了再生皮的生长速度，杜仲以PDG含量和分布部位变化产生生理补偿效应。

也有研究证实，不利于杜仲初生代谢的胁迫生态环境利于次生代谢产物的积累，其机制可能是由于胁迫刺激诱导体内某些酶的表达，增加了代谢过程中前体物质消耗，从而促进次生代谢产物的积累［17］。因此，可以考虑人为地对杜仲生长环境创造胁迫条件，营造具有一定环境压力的次适宜生态环境，在保证杜仲能正常生长的前提下，使PDG尽可能多积累，或者更确切地向某些部位积累。吴茜等［18］发现经裸根茎和露晒根胁迫处理后的杜仲，处理部位皮中PDG含量都有一定程度提高，虽仍未达入药标准，但由此说明通过干预措施可使各部位PDG积累情况发生改变，也为未来研究指明了改进方向。在此基础上，可以筛选并优化促进积累的胁迫处理条件，延长处理时间，考察PDG与前体物质平衡关系等，力求在提高杜仲干皮部位PDG含量的同时，使更多其它部位也能达到药用标准。

4 PDG提取方法

4.1 常规溶剂提取法

PDG是一种极性较强的水溶性成分，溶剂提取法经济简单，能利用PDG易溶于甲醇、乙醇等极性溶剂的特性，将其从植物中提取出来，产品得率高。陈晓青等［19］用60%乙醇水溶液提取PDG，所得提取率为90.21%。但此法提取时间较长，且对提取温度也有一定要求。

4.2 超声波辅助提取

超声波的空化、振动等效应能有效地破坏杜仲胶，击碎细胞壁，增强PDG在溶剂中的释放速率，同时在提取过程中温度升高不明显，可抑制挥发，从而最大限度地提取PDG。潘亚磊等［20］采用二水平实验及正交实验对PDG提取工艺进行优化，超声波辅助技术的加入缩短了传统提取工艺所需时间。邓伶等［21］采用60%甲醇作为提取溶剂，在频率40 kHz的超声提取器中于60℃下提取20 min。此方法过程简单，耗时短，且能达到比常规提取方法更理想的效果。

4.3 微生物发酵

刘超等［22］在前人研究的基础上从杜仲中筛选出PDG高产菌株拟茎点霉属（Phomopsis sp.）菌株XP-8，利用其具备的多种生物转化能力，使发酵转化在较温和的条件下进行，最大限度保护PDG成分免遭破坏，增强药理作用，但产物得率还较低。其相关研究尚在继续深入，试图通过代谢调控来增加PDG得率［23］。

5 PDG纯化方法

5.1 溶剂萃取法

杜仲中所含的杜仲胶极性较低，而PDG有一定极性，可采用溶剂萃取法进行两相萃取，除去大量杂质和固体物质，在短时间实现分相［24］。王月茹等［25］认为采用氯仿对杜仲提取液萃取3次，能够有效地去除提取液中脂溶性杂质的干扰。溶剂萃取法可进行连续操作，富集比高、产量高、成本低，适合于大规模工业化生产。

5.2 大孔树脂柱吸附法

大孔吸附树脂是一种亲脂性固体吸附剂，不含交换基因，适合于分离提纯水溶性化合物，其多孔性的高分子吸附剂能对混合物中待分离物质进行吸附、解析和筛选，从而达到分离和富集的目的。彭密军等［26］通过使用大孔吸附树脂-C18反相硅胶柱层析—正相硅胶柱层析联用技术，很大程度上提高了杜仲PDG的纯度。但该方法较为耗时，且树脂材料的清洗也存在难度。

6 结语

关于杜仲PDG的前期研究主要集中于提取纯化、药理作用等方面。用以提取、纯化PDG的技术方法除了一些相对成熟且常用方法外，还包括许多新兴技术，而各种方法既有优点，又存在局限性。因而在选择方法的过程中，需要从研究设备条件、生产成本等多方面来综合优选最适工艺，同时也可以采用多种技术联用的方式，以提高PDG的提取纯化率，增加原料的利用率。

当前对杜仲PDG体内生物合成与代谢途径的认识仍不完整，关于其合成、积累机制与调控靶点也还处于探索当中。随着鬼臼类结构木脂素生物合成途径的逐步解析［27］，人们对PDG生物合成途径的了解也将更深入。未来的研究工作应全面认识杜仲PDG的代谢网络，一方面，掌握PDG合成和积累变化以及分布变化的机制和规律，明确与前体物质的平衡关系，找准调控靶点，以获取大量的PDG合成与积累；另一方面，通过分析PDG积累机制，采用简单可行且易于推广的辅助措施来提升杜仲其它部位PDG含量，以扩大药源，充分发挥杜仲资源的利用潜力。

［1］ Deyama T，NishibiS，Nakezawa Y.Constituents and pharmacological effects of Eucommia and Siberian ginseng［J］. Acta Pharmacol Sic，2001，22（12）：1057-1070.

［2］ 杨忠杰.松脂醇二葡萄糖苷药代动力学和代谢产物研究［D］.郑州：河南大学硕士学位论文，2015.

［3］ 张 艳.绿豆促进拟茎点霉代谢合成松脂醇二葡萄糖苷的作用机制解析［D］.杨凌：西北农林科技大学博士学位论文，2016.

［4］ Zhang ZF，Min JK，Wang D，etal.Pinoresinol diglucoside exhibits protective effect on dexamethasone-induced osteoporosis in rats［J］.Tropical Journal of Pharmaceutical Research，2016，15（11）：2451-2457.

［5］ 邓 江，张 洁，罗 洁，等.杜仲提取物预处理对脑缺血—再灌注大鼠抗氧化能力及一氧化氮的影响［J］.中国新药与临床杂志，2012，31（8）：472-476.

［6］ 吴东儿，卞筱泓，许激扬，等.松脂醇二葡萄糖苷对ECV-304细胞损伤的保护作用和CAV-1表达的影响［J］.药物生物技术，2014，21（3）：218-221.

［7］ Vanholme R，Demedts B，Morreel K，et al.Lignin biosynthesis and structure［J］.Plant Physiol，2010，153（3）：895-905.

［8］ Suzuki S，Umezawa T.Biosynthesis of lignans and norlignans［J］.JWood Sci，2007，53：273-284.

［9］ Satake H，Ono E，Murata J.Recentadvances in themetabolic engineering of lignan biosynthesis pathways for the production of transgenic plant-based foods and supplements［J］.Agric Food Chem，2013，61：11721-11729.

［10］Morimoto K，Kim HJ，Ono E，et al.Effects of light on production of endogenous and exogenous lignans by Forsythia koreana wild type and transgenic cells［J］.Plant Biotechnol，2011，28：331-337.

［11］张康健，董娟娥.药用植物次生代谢［M］.西安：西北大学出版社，2001.

［12］王丽楠，杨美华.杜仲不同部位主要有效成分含量比较［J］.天然产物研究与开发，2009，21（1）：108-110.

［13］王丽楠，李 伟，覃洁萍，等.不同采收期杜仲不同部位主要有效成分的动态研究［J］.中国药业，2009，18（18）：29-31.

［14］杨林军，黄文平，吴永忠，等.杜仲板皮和枝皮中4种有效成分差异性比较［J］.中草药，2015，46（4）：584-587.

［15］苏文华，张光飞，李秀华，等.植物药材次生代谢产物的积累与环境的关系［J］.中草药，2005，36（9）：1415 -1418.

［16］冯锁民，甘志杰，翟西峰，等.杜仲原生皮与再生皮中松脂醇二葡萄糖苷的含量比较［J］.中药材，2006，29（8）：792-794.

［17］王玉明，李 锦，张丽媛，等.药用植物次生代谢产物积累规律的研究概况［J］.中南药学，2012，10（2）：136 -139.

［18］吴 茜，肖深根，张水寒，等.根干模拟生长处理对杜仲有效成分含量的影响［J］.作物研究，2015，29（2）：173-176.

［19］陈晓青，李宇萍，彭密军，等.杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的提纯［J］.中南工业大学学报（自然科学版），2003，34（3）：262-265.

［20］潘亚磊，郭玲丽，谢 培，等.杜仲松脂醇二葡萄糖苷的提取工艺优化［J］.化学与生物工程，2016，33（5）：42-45，66.

［21］邓 伶，李 江.杜仲药材含量测定样品处理方法优化［J］.亚太传统医药，2017，13（2）：34-36.

［22］刘 超，师俊玲，周小娟，等.产PDG杜仲内生菌的分离筛选和分类鉴定及生长条件研究［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2011，39（1）：203-209.

［23］Zhang Y，Shi JL，Gao ZH，etal.Production of pinoresinol diglucoside，pinoresinol monoglucoside，and pinoresinol by Phomopsis sp.XP-8 usingmung bean and itsmajor components［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2015，99：4629-4643.

［24］Sain RS，Ray S，Basu S.Synergism in solvent extraction and solvent Extraction kinetics［J］.Journal of Chemical，Biological and Physical Sciences，2014，4（4）：3156 -3181.

［25］王月茹，谢 伟，王西芳，等.HPLC测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量［J］.现代中医药，2009，29（6）：78-79.

［26］彭密军，吕 强，彭 胜，等.杜仲总木脂素及松脂醇二葡萄糖苷的纯化研究［J］.林产化学与工业，2014，34（6）：88-92.

［27］Lau W，Sattely ES.Six enzymes from mayapple that complete the biosynthetic pathway to the etoposide aglycone［J］.Science，2015，349：1224-1228.

R284.1

A

1001-5280（2017）05-0553-04

10.16848／j.cnki.issn.1001-5280.2017.05.23

2017-04-11

刘 倩（1991-），女，硕士研究生，Email：393244971＠qq.com。*通信作者：肖深根，博士，教授，Email：2395265030＠qq.com。