糖原累积病Ⅵ型和Ⅸa型7例病例报告并文献复习

刘 杰 张梅红 龚敬宇 王建设，2

·论著·

糖原累积病Ⅵ型和Ⅸa型7例病例报告并文献复习

刘 杰1张梅红1龚敬宇1王建设1，2

目的 总结糖原累积病(GSD)Ⅵ、Ⅸa型的临床、病理和基因突变情况，提高临床对这两型GSD的认识。方法 回顾性收集GSD3例Ⅵ型和4例Ⅸa型患儿的临床资料。结果 ①7例患儿均为男性，确诊年龄2岁3月至5岁。7例均有肝脏肿大和转氨酶升高，身材矮小1例，空腹低血糖、高乳酸血症和高甘油三酯血症各2例，血酮体增高3例，尿有机酸分析结果阳性2例。7例患儿均有肝细胞弥漫性肿大变形和糖原凝聚，4例有肝脏脂肪变性；3例GSDⅥ型有门管区纤维化、肝硬化表现。3例GSD Ⅵ型检测到6种PYGL基因突变，c.772+1G>A、c.244-1G>A、c.730C>T (p.L244F)、c.2417_2418delTA (p.I806SfsX9)为新突变，4例GSDⅨa型检测到4种PHKA2基因突变，c.3529C>T(p.Q1177X)、c.3574C>T(p.Q1196X)为新突变。②复习文献共检索到13篇文献，与本文病例合并后共22例Ⅵ型、99例Ⅸa型GSD。肝脏转氨酶增高和肝脏肿大91.9%～100%，有身材矮小18%～23%、空腹低血糖44%～48%、高甘油三酯血症37%～44%、高乳酸血症35%～72%和血酮体增高50%～56%。肝脏活检均可见肝细胞内糖原凝聚，17%有脂肪变性， Ⅵ型25%、Ⅸa型33%检出肝硬化。报道19种PYGL基因突变，多为点突变，剪切位点突变亦较常见，插入突变少见；43种PHKA2基因突变，突变类型多样。结论 肝大伴转氨酶升高的患儿需警惕Ⅵ、Ⅸa型GSD；Ⅵ型患儿可早期存在肝硬化，需要进一步随访。

糖原累积病； 肝脏活检； 基因突变

糖原累积病(GSD)是一组先天性酶缺陷导致的糖原代谢障碍性疾病。由于糖原分解障碍，在肝脏、肌肉和肾脏等组织中异常堆积，引起受累组织功能障碍及代谢异常，导致肝脏肿大、生长发育迟缓、转氨酶升高、低血糖和高脂血症等表现[1]。目前已经证实由糖原合成和分解代谢中所必需的酶缺陷所造成的糖原累积病共12型，其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅸ型累及肝脏。GSDⅥ型和Ⅸ型糖原累积病均系肝磷酸化酶系统异常，临床表现相似，诊断较困难，国内相关病例报告少见。现回顾分析近年来复旦大学附属金山医院儿科经基因检测确诊为GSDⅥ型和Ⅸa型患儿的特点，以增强对GSDⅥ、Ⅸa型的了解。

1 方法

1.1 研究对象纳入标准 2012年12月至2016年2月复旦大学附属金山医院儿科经皮肝穿刺病理检查诊断为GSD后，基因检测确诊为Ⅵ型和Ⅸa型的病例。

1.2 资料截取 临床表现、实验室检查、肝脏病理和基因突变，治疗和随访数。

1.3 肝脏病理检查 经监护人签署知情同意书后行经皮肝穿刺术，留取2份1.5～2 cm标本，1份予4%甲醛固定、石蜡包埋切片，行HE染色、过碘酸希夫法(PAS)染色和淀粉酶消化后PAS染色(D-PAS染色)、网状染色和Masson染色等，光镜下观察；另1份予4%戊二醛固定，透射电镜下观察组织细胞的超微病理改变。糖原累积病的典型病理表现为肝细胞肿胀变形，并可见糖原颗粒凝聚。

1.4 基因检测方法 收集患儿的EDTA抗凝全血标本1.5 mL，用QIAamp@DNA Mini Kit提取试剂盒(美国QIAGEN公司)提取全血基因组DNA。使用GSD深度测序panel检测已知的19种GSD基因(GYS2、G6PC、SLC37A4、GAA、AGL、GBE1、PYGM、PYGL、PFKM、PHKA2、PHKB、PHKG2、PHKA1、PGAM2、LDHA、ALDOA、ENO3、PGM2、GYG1)。测序结果采用Blast工具与美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的基因组序列进行比对(PYGL和PHKA2使用的参考序列分别为NM_002863和NM_000292)，搜索千人基因组数据库和HGMD数据库，查看检测到的突变位点是否已有报道。对新突变应用Clustal X进行物种间序列比对，查看基因物种间同源性及突变位点保守性。用Polyphen2和Mutation Taster软件预测氨基酸替换对基因编码蛋白的结构及功能的影响，Polyphen2通过计算特定位置独立计数得分来评估2种氨基酸替换后致病的可能性；分数越接近1.0，损害可能越大；越接近0，损害可能越小。

1.5 文献检索 以“glycogen storage disease type Ⅵ、Ⅸa”为主题词检索Pubmed数据库，以“糖原累积病”为关键词在万方数据库检索，检索时间为2007年1月1日到2017年7月31日。

2 结果

2.1 病例资料 符合本文纳入标准的连续样本中，3例Ⅵ型GSD，4例Ⅸa型GSD。7例均为男性，确诊年龄2岁3月至5岁，来自不同家庭，父母非近亲婚配。

2.1.1 临床表现和实验室检查结果 除例1因“发现腹部膨隆”就诊外，6例均因“体检发现转氨酶升高”就诊。表1显示，腹部触诊及B超均存在肝脏肿大；除例2身材矮小(身高低于同年龄、同性别儿童身高的第三百分位数)外，6例身高均正常；实验室检查结果显示，转氨酶均升高， 例4和7空腹低血糖(<3.9 mmol·L-1)，例1和3高乳酸血症(>2.2 mol·L-1)，例3和4高甘油三酯血症(>1.7 mmol·L-1)，例1、5和6血酮体升高，例1为丙酮酸增高，例2为3-羟基丁酸增高。

表1 7例GSD患儿确诊时临床表现和实验室检查结果

注 +：阳性结果；-：阴性结果；/：未检测；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；TG：甘油三酯；1)：U·L-1；2)：mmol·L-1

2.1.2 肝脏病理检查结果 表2显示，肝脏病理表现均符合典型GSD，HE染色提示肝细胞弥漫性肿大变形，呈窗格样排列(图1A)，例1、2、4和6有肝脏脂肪变性；PAS及D-PAS染色显示肝细胞内糖原凝块形成；电镜下可见肝细胞体积增大，排列紊乱，胞浆内充满糖原颗粒和大小不等脂滴(图1B)； 3例GSDⅥ型患儿均有肝脏小叶结构紊乱，局部假小叶形成，网状染色和Masson染色显示门管区广泛纤维化形成，提示肝硬化(图1C、D)。

2.1.3 基因分析结果 表3显示，3例GSD Ⅵ型患儿发现6种PYGL基因突变。 2种为已知突变，c.1366G>A p.V456M系缬氨酸被体积较大的甲硫氨酸取代，可阻止底物与酶的结合，导致酶活性下降[2]；c2467C>T p.Q823X为无义突变，导致蛋白编码提前终止[3]。余4种为新突变，c.730C>T p.L244F为错义突变，其对应突变、插入缺失突变均多见。

表2 7例GSD患儿肝脏病理表现

注 +：阳性结果；-：阴性结果；/：未检测

图1 GSD患儿肝脏病理

注 A：肝细胞弥漫样变性，呈窗格样排列(HE，×400)； B：肝细胞体积增大，排列紊乱，胞浆内充满糖原颗粒和大小不等脂滴(电镜，10 μm)；C、D：网状染色和Masson染色提示门管区广泛纤维化形成，肝硬化趋势

的氨基酸位点L244在人、猩猩、大鼠和小鼠中均高度保守，Mutation Taster软件预测为致病性突变；c.2417_2418delTA导致读码框移，从第806位氨基酸开始改变，并导致翻译提前终止，最终合成的蛋白质较正常少9个氨基酸，Mutation Taster软件预测为致病性突变；c.772+1G>A和c.244-1G>A可影响RNA的剪接异常，Mutation Taster软件预测为致病性突变。例2经过父母基因验证为复合杂合突变，其中c.772+1G>A来自父亲，c2467C>T p.Q823X来自母亲；例1和例3未行父母基因验证，未明确变异来源。

表3显示，4例GSDⅨa型患儿，发现4种PHKA2基因突变，均为半合子，2种为已知致病突变(c.390G>C p.W130C，c.2746C>T p.R916W)，2种为新突变(c.3529C>T p.Q1177X，c.3574C>T p.Q1196X)。其中c.390G>C p.W130C系cDNA第390位G变成C，编码色氨酸变为半胱氨酸，推测使α亚单位的结构发生了变化，继而使PHK的活性受到影响，Clustal X序列比对及Polyphen2软件预测进一步支持该突变是引起糖原累积病的原因。c.2746C>T p.R916W为错义突变，其所对应的氨基酸位点R916在人类、小鼠、禽类和河豚属中均高度保守，预测为致病性突变。其余2种突变均为终止密码突变，可明确为致病性突变。

2.1.4 治疗和随访情况 7例患儿均予以口服生玉米淀粉和补充蛋白质进行治疗。3例GSDⅥ型中例2定期随访，腹部B超提示肝脏肿大情况好转，转氨酶略下降，尿酮转阴，例1和3失访；3例GSDⅨa型(例5、6和7)随访显示腹部触诊及B超均提示肝脏肿大明显好转，生化检查肝脏转氨酶下降，例5、6血酮体恢复正常，例7低血糖恢复；例4失访。

表3 GSD患儿基因检测结果

注 1)：新发现突变

2.2 文献检索结果 以本文设定的检索策略检索Ⅵ和Ⅸa型GSD的病例报告，共检索到12篇英文、1篇中文文献，排除重复报道病例，与本文病例合并后共22例Ⅵ型GSD、99例Ⅸa型GSD，临床表现、生化结果和肝脏病理表现汇总见表4。

22例GSD VI型确诊年龄为1月至6岁，男14例，女8例，均有肝大，矮小18%(4/22)；转氨酶增高96%(21/22)，高乳酸血症72%(13/18)，高甘油三酯血症44%(8/18)，低血糖44%(8/18)，4例监测酮体者中2例明显增高；12例行肝穿刺检查均可见肝细胞内糖原凝聚，脂肪变性17%(2/12)，肝硬化25%(3/12)。

99例GSD Ⅸa型患儿确诊年龄1月至14岁，均为男性，肝大92%(91/99)，矮小23%(23/99)，转氨酶增高93%(92/99)，高乳酸血症35%(26/75)，高甘油三酯血症有37%(28/76)，低血糖48%(42/88)，血酮体增高56%(9/16)；36例患儿进行了肝脏穿刺检查，均有肝细胞内糖原凝聚表现，脂肪变性17%(8/36)，肝硬化33%(12/36)。

22例Ⅵ型GSD和99例Ⅸa型GSD患儿的基因检查结果显示，PYGL基因的突变多为点突变，造成编码的氨基酸改变或基因表达提前终止，剪切位点突变亦较常见，插入突变仅1例；PHKA2基因突变类型多样，点突变、剪切位点突变、插入缺失突变均多见。

表4 已报道的19例GSDⅥ型和95例IXa型和本文报道的临床表现、生化结果和肝脏病理表现

注 *：作者未说明具体例数；1)奥地利；2)芬兰；3)阿根廷；4)巴基斯坦

表5 PYGL和PHKA2基因突变情况

注 1)：GAACAGGCC；2)：TGGAGAAAGACCA

3 讨论

Ⅵ型和Ⅸa型GSD的临床表现相似，多在婴幼儿期出现临床症状，大部分患儿有肝脏肿大和肝脏转氨酶增高，部分有生长迟缓，典型表现还有低血糖，高乳酸血症、高脂血症和血酮体增高[2-14]。GSD Ⅵ型又称Hers病(MIM#232700)，是一种常染色体隐性遗传病，发病率约1/60 000至1/85 000，由于PYGL基因编码的肝磷酸化酶缺陷，导致肝细胞内糖原分解不足、ATP生成不足和功能障碍而引起[1]。PYGL基因定位于14号染色体的q22.1，包含20个外显子，约40kb。GSDⅨ型由于磷酸化酶激酶(PHK)缺陷引起，该酶由α、β、γ和δ4个亚单位组成。Ⅸa型最常见(MIM#306000)，约占75%，系编码α亚单位的PHKA2基因异常引起，导致不能激活肝磷酸化酶，引起糖原分解障碍[1]。PHKA2基因位于X染色体p22.13，包含34个外显子。Ⅸa型GSD属于X连锁隐性遗传性疾病，其基因突变形式表现多样。

复习文献，与本文病例合并后共22例Ⅵ型和99例Ⅸa型GSD。文献报道Ⅵ型全部有肝大，Ⅸa型91.9%肝大，Ⅵ型95%肝脏转氨酶增高，Ⅸa型93%肝脏转氨酶增高，提示肝大和肝脏转氨酶增高极具特征性；身材矮小的发生率较低(Ⅵ型18%，Ⅸa型23%)；GSD的典型表现还有低血糖、高甘油三酯血症和高乳酸血症，GSDⅥ型患儿的低血糖发生率为44%，而 GSDⅨa型患儿为48%，无低血糖患儿可能系糖异生途径未受到影响；高乳酸血症的发生率分别为72%和35%、高甘油三酯血症的发生率分别为44%和37%，血酮体增高的发生率分别为50%和56%，可能系患者的酶活性未完全丧失所致。肝脏病理检查：所有患儿均可见肝细胞内糖原凝聚，Ⅵ型和Ⅸa型均有17%检出脂肪变性， Ⅵ型25%、Ⅸa型33%检出肝硬化。基因突变：PYGL基因突变中错义突变的发生率最高，为53%(10/19)，剪切突变为26%(5/19)，无义突变为16%(3/19)，框移突变仅1例(5%)，无大片段缺失的发生。PHKA2基因的突变谱较广，文献复习共发现43种突变，错义突变占47%(20/43)，框移突变占21%(9/43)，无义突变占14%(6/43)，缺失突变和剪切位点突变各有4例(9%)；值得一提的是，PHKA2基因的大片段缺失均发生在韩国人群中。

综上所述，本文报告3例Ⅵ型和4例Ⅸa型GSD患儿，并发现6种既往未见报道的新突变，丰富了PYGL和PHKA2基因突变谱。复习文献显示，Ⅵ型和Ⅸa型GSD患儿肝脏肿大和转氨酶增高为最突出表现，部分有身材矮小、低血糖、高甘油三酯血症、高乳酸血症和血酮体增高，提示对肝脏肿大和转氨酶增高的患儿需考虑糖原累积病Ⅵ、Ⅸa型的可能。部分患儿肝脏病理检查发现肝硬化，结合以往报道其可发生肝腺瘤，提示其结局可能并非良性。

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Report of 7 cases of glycogen storage disease type Ⅵ and type Ⅸa

LIUJie1,ZHANGMei-hong1,GONGJing-yu1,WANGJian-she1，2

(1.DepartmentofPediatrics,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China; 2.MolecularDiagnosisLabofPediatricsResearchInstitute,Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China)

GONG Jing-yu, E-mail: Gong Jing-yu1651@163.com; WANG Jian-she, E-mail: jshwang@shmu.edu.cn

ObjectiveTo summarize the clinical, liver biopsy and gene mutation features of glycogen storage disease type Ⅵ and Ⅸa, so as to improve the clinical understanding of the disease. MethodsA retrospective analysis was performed on seven cases' (3 cases of type Ⅵ , 4 cases of type Ⅸa)clinical manifestation, laboratory examination, liver biopsy and gene mutation spectrum. Related literatures of GSDⅥ and Ⅸa were reviewed and the clinical, liver biopsy and genetic features were summarized..Results①All the 7 cases were male and diagnosis age was 2 years 3 months to 5 years. There were 7 cases with hepatomegaly and transaminase elevation, 1 case with short stature, 2 cases with fasting hypoglycemia, 2 cases wtih hypertriglyceridemia and hypertriglyceridemia, 3 cases with blood ketone bodies, 2 cases with positive analysis of urine organic acids; 7 patients'liver biopsy revealed diffuse enlargement of hepatocytes with glycogen aggregation, 4 cases with hepatic steatosis; cirrhosis with portal fibrosis was presented in 3 cases of GSD Ⅵ. 6PYGLmutations were detected in 3 patients of type Ⅵ, c.772+1G>A, c.244-1G>A, c.730C>T(p.L244F), c.2417_2418delTA (p.I806SfsX9)were novel, 4PHKA2 mutations were detected in 4 patients of type Ⅸa, c.3529C>T(p.Q1177X), c.3574C>T(p.Q1196X) were novel. ②13 literatures were retrieved, together with the 7 cases in this study, there were 22 cases of GSD Ⅵ and 99 cases of GSDⅨa. Almost all the children had hepatomegaly and transaminase elevation, some patients had short stature, fasting hypoglycemia, hypertriglyceridemia, hypertriglyceridemia and blood ketone bodies. All the patients' liver biopsy revealed glycogen aggregation in hepatocytes , 17% showed hepatic steatosis, liver cirrhosis was presented in 25% of type Ⅵ and 33% of type Ⅸa patients. 19PYGLgene mutations were reported, most were point mutations, splice site mutation was common and insertion mutation was rare. 43PHKA2 gene mutations were reported and the types were variant.ConclusionThe patients with hepatomegaly accompanied by elevated transaminase should be alerted to be with glycogen storage disease type Ⅵ or Ⅸa; patients with type Ⅵ may have cirrhosis early and require to be further followed-up.

Glycogen storage disease; Liver biopsy; Gene mutation

2017-07-21

2017-08-23)

(本文编辑：张崇凡，孙晋枫)

1.复旦大学附属金山医院儿科 上海，201508；2.复旦大学附属儿科医院儿童肝病中心 上海，201102

龚敬宇，E-mail：gongjingyu1651@163.com；王建设，E-mail：jshwang@shmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2017.04.009