剪刀股中挥发油的稳定性及抑菌作用研究

孙晓丽，王威

(1.河北省易县妇幼保健院，河北 保定 074200；2.河北省张家口市妇幼保健院，河北 张家口 075000)

·中药工业·

剪刀股中挥发油的稳定性及抑菌作用研究

孙晓丽1*，王威2

(1.河北省易县妇幼保健院，河北 保定074200；2.河北省张家口市妇幼保健院，河北 张家口075000)

目的：优化剪刀股挥发油的提取方法，测定其稳定性，研究其抑菌作用。方法：通过正交试验优化剪刀股挥发油的提取条件；采用初均速法，以折光率为测定指标，确定剪刀股挥发油稳定性；测定剪刀股挥发油对大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌等菌种的抑菌作用。结果：采用挥发油提取器提取剪刀股挥发油的最佳提取条件为氯化钠溶液浓度6%，浸泡时间1h，料液比10∶1，提取时间5h；平均提取率为0.466%，RSD为0.3277%；剪刀股挥发油在25℃时的半衰期为8.74年；剪刀股挥发油在浓度为0.6%时，抑菌作用与氯霉素相当。结论：剪刀股中挥发油稳定性较好，并对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定抑菌作用。

剪刀股；挥发油；提取；稳定性；抑菌作用

剪刀股(IxerisdebilisA.Gray)属于菊科苦荬菜属植物，广泛生长于我国北方各地，是我国北方重要的药食两用植物，民间主要用于肺热咳嗽、喉痛、口腔溃疡、急性结膜炎、阑尾炎等症的辅助治疗[1]。笔者经实验发现，剪刀股中含有一定量的挥发油。本实验对剪刀股中挥发油的提取、稳定性作进一步的研究，并以氯霉素为对照进行了抑菌实验。优化剪刀股挥发油的提取方法，了解剪刀股挥发油的稳定性，阐明其抑菌特性，为剪刀股的综合利用开辟一条新途径，也为从剪刀股中提取高效低毒的抑菌成分提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1仪器

DK-8B型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；阿贝折光仪(上海光学仪器厂)；GNP-9080隔水式电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2试药

大肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓杆菌(Pseudomnas)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusareus)均由河北北方学院生命科学研究中心实验室友情馈赠；牛肉膏蛋白胨培养基用于培养细菌，所用培养基均符合GB4789.28-94标准；其他试剂均为国产分析纯；实验用水为三重蒸馏水。

剪刀股采自河北省张家口市郊区，由河北北方学院赵恒诚教授鉴定为菊科植物IxerisdebilisA.Gray正品。

2 方法

2.1剪刀股挥发油的提取

2.1.1 水蒸汽蒸馏法提取剪刀股挥发油的工艺流程 将剪刀股地上部分室温干燥后，粉碎为粗粉。取剪刀股粗粉适量，加入一定量NaCl溶液浸泡后，置于挥发油提取器中提取5 h，收集挥发油[2]，按照下列公式计算挥发油提取率。

剪刀股挥发油提取率(%)=提取出的挥发油质量(g)/剪刀股质量(g)×100%

(1)

2.1.2 正交试验设计 在预实验的基础上，选择提取溶剂NaCl溶液浓度、浸泡时间及液料比3个因素作为考察对象，以挥发油提取率为考察指标，采用L9(34)正交试验设计进行实验，计算剪刀股挥发油的提取率，优化提取工艺，因素和水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2.1.3 验证试验 取剪刀股粗粉适量，共3份，按照正交试验确定的最佳提取工艺进行提取，计算剪刀股挥发油提取率。2.2剪刀股挥发油稳定性研究

精密量取剪刀股挥发油8份，各0.5 mL，置于5 mL的具塞试管中，按照表2分别在不同温度下，水浴至一定时间，进行恒温加速破坏。到设定时间后，立即取出试管停止加热，置于冷水中降至室温，保证反应能够立即停止，测定恒温加热后挥发油的折光率[3-4]。

2.3剪刀股挥发油抑菌作用的研究

2.3.1含菌平皿的制备 将斜面活化好的大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌菌种用无菌水分别稀释制成含菌数约103CFU·mL-1的菌悬液，各取1mL与牛肉膏蛋白胨固体培养基制成含菌平皿，备用。

表2 不同温度下剪刀股挥发油的折光率

2.3.2 挥发油体外抑菌活性 将剪刀股挥发油用丙三醇稀释配成0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的系列浓度的溶液。按照相关文献[5-6]所做抑菌实验进行抑菌实验，培养结束后测量抑菌圈的直径。同时，用氯霉素(终浓度为0.01%)和蒸馏水代替剪刀股挥发油加入到培养基中作为对照实验。

3 结果

3.1挥发油提取结果

正交试验结果见表3，方差分析见表4。由表3可见,对剪刀股挥发油提取率影响最大的是液料比，其次为NaCl溶液浓度，其中液料比对剪刀股挥发油提取率的影响有显著性(P<0.05)，剪刀股最佳提取工艺为A3B2C3，即NaCl溶液浓度6%，浸泡时间1 h，液料比10∶1。按照正交试验确定的最佳提取工艺进行3次提取，剪刀股挥发油提取率分别为0.465%、0.466%、0.468%，平均提取率为0.466%，RSD=0.327 7%。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

3.2剪刀股挥发油稳定性研究结果

3.2.1数据处理 根据数学模型[7]，数据用数理统计法处理。用公式Vi=(ni-n0)/ti计算不同温度下的平均速度(即初速度)。

其中n0为室温下剪刀股挥发油的折光率，ni为不同温度下经相应时间恒温破坏后测得的剪刀股挥发油折光率，ti为不同温度下对应的时间(h)，其中i分别是1、3、4、5、6、7和9。

3.2.2回归方程的绘制 纵轴Y取(Vi+10)×5代表ki，横轴X取1/T×103，作Arrhenius图，得线性回归方程Y=-37.861X+118.99，相关系数r=0.998。

3.2.3剪刀股挥发油的半衰期 根据Arrhenius公式ki=-Ea/RT+lnA，求得活化能Ea=314.776KJ·mol-1。由Arrhenius回归方程求出V298K，则k298K=9.057×10-6h-1。根据一级反应动力学方程式分别求得298K时，t0.9=1.33年，t0.8=2.81年，t0.7=4.50年，t0.5=8.74年，即挥发油消耗10%需要1.33年，消耗20%需要2.81年，消耗30%需要4.50年，半衰期为8.74年。表明剪刀股挥发油在室温稳定。

3.3剪刀股挥发油抑菌作用的研究结果

剪刀股挥发油抑菌效果见表5。

表5 剪刀股挥发油对细菌的抑菌效果(以抑菌圈直径表示，mm)

注：“-”表示无抑菌效果。

由表5可知，剪刀股挥发油对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，并且其抑菌作用随着浓度的增大而增强。其中浓度为0.6%的剪刀股挥发油的抑菌效果与0.01%氯霉素的抑菌效果相当。

4 讨论和结论

本实验采用水蒸汽蒸馏的方法提取剪刀股挥发油，由于前期研究发现剪刀股挥发油水溶性较高，为避免损失，采用氯化钠溶液为溶剂，通过盐析作用使其能够更好地从水中分离出来[8]。实验证明，氯化钠浓度为6%时，能获得较好的分离效果。提取前用溶剂浸泡药材一定时间，有助于组织细胞间隙增大，促进挥发油由细胞转移至溶剂中，对提取有一定的作用，但浸泡时间过长可能导致挥发油的挥发增加，降低提取率。本实验证明，剪刀股挥发油的提取中用氯化钠溶液浸泡1 h即可获得较好的提取效果。实验结果证明，液料比对剪刀股挥发油的提取率具有较显著的影响，应该与剪刀股挥发油在水中的溶解度较高有关。预实验中发现，提取时间超过5 h，提取率基本不再增加，因此本实验将提取时间统一定为5 h，未在正交试验中加以考察。

挥发油受热后分解，则其多项物理性质发生变化。本研究以剪刀股挥发油在受热后的折光率变化为测定指标[9]，采用初均速法测定剪刀股挥发油的半衰期，跟经典恒温加速实验法比较，初均速法效率更高，取样次数少，更为简单快捷，操作难度降低。实验证明，剪刀股挥发油在25 ℃的半衰期为8.74年，稳定性较好，能够满足药用的要求。

剪刀股挥发油对大肠杆菌、绿脓杆菌、金葡菌具有一定的抑制作用，特别是当其浓度达到0.6%时，与浓度为0.01%的氯霉素相当，此结果从实验层面验证了剪刀股“清热解毒”的活性，为剪刀股的开发利用提供了实验依据。

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StudyonStabilityofVolatileOilsfromIxerisdebilisandItsAntibacterialEffect

SUN Xiaoli1*，WANG Wei2

(1.Women and Children Hospital of Yixian，Hebei，Baoding 074200，China；2.Pharmacy of Women and Children of Zhangjiakou，Hebei，Zhangjiakou 075000，China)

Objective：To optimize the extraction of volatile oils inIxerisdebilisand study its stability and antibacterial effect.Method：The best extraction process of the inI.debiliswas evaluated by orthogonal design.The refractive index were measured to predict the stability using initial average rate stability test.The growth inhabiting effect of the volatile oilsonEscherichiacoli，PseudomnasandTaphylococcusareuswas determined.Result：The best condition of extracting thevolatile oils fromI.debiliswas follows：soaking in 10 times (volume/quality) sodium chloride solution (6%) for 1h，and heating for 5 h.The Extraction yield of thevolatile oils inI.debiliswas 0.466% (RSD=0.327 7%).The t1/2of the volatile oils in the temperature of 298 k was 8.74 years.The effect of antibacterial growth inhibition of the volatile oils (0.6%) was similar to chloromycetin (0.01%).Conclusion：Thevolatile oils is stable and has obvious effect of growth inhibition onEscherichiacoli，PseudomnasandTaphylococcusareus.

Ixeris debilis A.Gray；volatile oils；extract；stability；Bacteriostatic action

] 孙晓丽，副主任药师，研究方向：中药新药研究；e-mail：xiaoli_sunbaoding @163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.028

2016-12-03)

*[