基于药效学及正交试验优选双贯清感滴丸的提取工艺△

逯双，陈明月，曹广尚，杨培民

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011)

基于药效学及正交试验优选双贯清感滴丸的提取工艺△

逯双1，陈明月1，曹广尚2*，杨培民2*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011)

目的：优选复方组分中药双贯清感滴丸的提取工艺。方法：以反映该制剂抗流感病毒的药效学指标比较双贯清感滴丸的水提和不同浓度的乙醇提取工艺，继以主要指标成分金丝桃苷、绵马贯众素含量综合评分，采用正交试验考察双贯清感滴丸优选工艺的乙醇浓度、溶剂用量、提取时间和提取次数。结果：根据抗流感病毒的药效学指标肺指数、肺指数抑制率以及理化指标金丝桃苷、绵马贯众素的含量，可得双贯清感滴丸最佳提取工艺为加10倍量75%乙醇，回流提取2次，每次1 h。结论：结合药效学优选的双贯清感滴丸提取工艺稳定可行，对保障制剂疗效具有指导性意义。

双贯清感滴丸；药效学指标；正交试验；提取工艺

双贯清感滴丸组方源于山东中医药大学附属医院名老中医临床经验，由绵马贯众、贯叶金丝桃等药味组成，是以“复方组分中药”研究模式，采用现代分离纯化技术制备的具有清热、解毒、透表之功能，用于邪毒所致时行感冒的复方组分中药。

传统提取工艺研究多采用方中有效成分含量为指标，而中药制剂成分复杂，其物质基础不明确，仅以化学成分作为参考指标并不能全面评价制剂工艺[1-2]，因此本课题基于抗流感病毒作用的药效学指标[3-5]，对目前常用的提取方式传统水煎煮和现代醇提取进行优选，并以处方中绵马贯众素和金丝桃苷的含量作为主要理化指标[6-9]，采用正交试验进一步筛选双贯清感滴丸的提取工艺，为本品的临床疗效提供保障。

1 仪器与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；LC-600B型数控超声波清洗机(山东济宁鲁超超声设备有限公司)；XMTD-4000型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；AB135-S型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。

健康昆明种小白鼠40只，体重18～22 g，雌雄各半，由山东大学动物实验中心提供。流感病毒亚甲型，鼠肺适应株FM1，由山东省医学科学院提供，-70 ℃冰箱保存，经复苏后在鸡胚中传代备用。

金丝桃苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111521-201507)；绵马贯众素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：10438-070234)；乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。

贯叶金丝桃、绵马贯众药材均由山东中医药大学附属医院药学部提供，经山东中医药大学附属医院马传江副主任药师鉴定分别为藤黄科植物贯叶金丝桃HypericumperforatumL.的干燥地上部分、鱗毛藤科植物绵马贯众DryopteriscrassirhizomaNakai的干燥根茎和叶柄残基。

2 方法与结果

2.1 水提液和醇提液的制备

中药所含成分复杂，包括有效成分、辅助成分及无效成分，根据物质性质不同，采用不同提取方法提取后所含的中药成分也不尽相同。因此，筛选中药的提取溶剂以达到最佳药效尤其重要。本课题基于抗流感病毒作用的药效学指标，对目前最常用的提取方式传统水煎煮和现代乙醇提取进行优选，并设计不同浓度的乙醇提取，以考察提取溶剂对药效的影响。故按处方比例称取绵马贯众、贯叶金丝桃两味药材共4份，分别加12倍量水、8倍量60%乙醇、8倍量75%乙醇、8倍量90%乙醇，煎煮/回流提取2次，每次2 h，合并煎煮液浓缩至1 g·mL-1的溶液。

2.2 初步药效学优选

取昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为7组[10-11]，每组10只，分别编号为正常对照组、模型组、病毒唑组、水提取组、60%乙醇提取组、75%乙醇提取组和90%乙醇提取组。用乙醚浅麻醉小鼠后，正常对照组以0.9%氯化钠溶液滴鼻，每只50 μL，其余各组选用流感病毒鼠肺适应株FM1，以15个LD50病毒浓度，每只50 μL滴鼻感染小鼠。感染4 h后给小鼠灌胃给药，水提液和醇提液剂量为10 mL·kg-1，病毒唑组给药剂量为70 mg·kg-1，正常对照组给予相同体积的蒸馏水，每日1次，连续5 d。末次给药2 h后，颈椎脱臼处死小鼠，称量体重，解剖摘取全肺称重，计算肺指数与肺指数抑制率，结果见表1。

(1)

肺指数抑制率=

表1 双贯药材不同提取工艺对小鼠感染病毒肺指数的影响

注：与正常对照组比较，##P<0.01；与病毒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;“—”表示无。

小鼠感染流感病毒5 d后处死，解剖发现，模型组小鼠肺部病变明显，其肺指数与正常对照组比较具有显著性差别(P<0.01)，表明此模型成立。病毒唑组、水提取组及乙醇提取组对抗小鼠肺炎病变均有明显抑制作用，3个浓度的乙醇提取液组之间无显著性差异，但相对水提液组对FM1所致小鼠肺脏损伤均具有明显保护作用(P<0.01)。不同提取方式导致药物不同有效成分的溶出，从而有药效不同程度的显现。药效学结果显示，3个浓度的乙醇提取组效果明显优于水提组，说明药物有效成分更易溶解在乙醇中而发挥药效，而75%乙醇提取组抗流感效果最好，因此初步确定以75%乙醇进行提取，并在此基础上继续进行工艺参数优选。

2.3 正交试验设计

优选乙醇对贯叶金丝桃、绵马贯众的提取工艺，采用正交试验，分别以金丝桃苷、绵马贯众素的含量为指标，对乙醇浓度、溶剂倍量、提取时间及提取次数进行考察。见表2。

按处方比例称取贯叶金丝桃、绵马贯众药材饮片，按照正交试验设计因素水平表进行试验，以乙醇回流提取，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩成稠膏状，减压干燥，即得干浸膏。

表2 正交设计因素水平表

2.3.1 指标成分的测定

2.3.1.1 色谱条件 kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(16∶84)；检测波长为360 nm(检测金丝桃苷)；流动相为乙腈-三氯甲烷-异丙醇-0.5%磷酸(52∶8∶30∶10)；检测波长285 nm；柱温25 ℃(检测绵马贯众素)；流速为1.0 mL·min-1；进样量10 μL；柱温为25 ℃。

2.3.1.2 对照品溶液的制备及标准曲线的绘制 精密称取金丝桃苷对照品5.15 mg、绵马贯众素对照品5.96 mg，分别加入甲醇、三氯甲烷稀释置25 mL容量瓶中，摇匀即得金丝桃苷及绵马贯众素对照品储备液。

分别精密吸取两种对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分别置于10 mL容量瓶中，甲醇定容分别制备不同浓度的对照品混合溶液，按照以上色谱条件进样，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品的进样量(X)为横坐标，分别得金丝桃苷标准曲线:Y=7 759.2X-532.09，r=0.999 0，线性范围0.206～1.236 μg；绵马贯众素标准曲线:Y=2 615 494.75X+6 885.04，r=0.999 9，线性范围0.238 4～1.430 4 μg。

2.3.1.3 供试品溶液的制备 取浸膏粉约1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，补足失重，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 结果 按照L9(34)正交设计表的条件进行试验，以金丝桃苷、绵马贯众含量为指标成分进行综合评分，优选最佳工艺。金丝桃苷、绵马贯众素作为双贯滴丸的主要指标成分，通过比较发现，两种指标成分在75%的乙醇提取物中含量较其他浓度乙醇提取组中要高，这与75%乙醇提取组具有较好的抗流感病毒作用一致，说明理化性质指标绵马贯众素及金丝桃苷含量与其体现的药效学指标可能具有一定程度的正相关性。

因处方中以贯叶金丝桃及绵马贯众为主，故将金丝桃苷、绵马贯众素权重系数分别定为0.5和0.5。总分=(金丝桃苷含量/金丝桃苷最高含量×0.5+绵马贯众素含量/绵马贯众素最高含量×0.5)×100%。实验结果见表3，方差分析见表4。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

直观分析表明，在所选因素水平范围内，对主要成分提取率影响顺序为A>D>B>C。方差分析表明，乙醇浓度(A)和提取次数(D)对提取的影响均具有显著性，溶剂倍数(B)和提取时间(C)对提取影响不显著。综合各因素水平及方差分析得出最佳提取工艺为A2B3C2D2，结合提取完全因素，考虑到节约能源等实际生产情况，最终确定最佳提取工艺为A2B2C1D2，即10倍量75%乙醇，回流提取2次，每次1 h。

2.3.3 验证试验 为验证优选工艺的可靠性及稳定性，按处方比例称取药材共3份，每份150 g，按上述优选最优提取工艺进行验证试验，按2.2.1项下方法测定指标成分含量，结果绵马贯众素总提取量分别为72.96、72.91、73.02 mg·g-1，贯叶金丝桃提取量分别为1.43、1.45、1.42 mg·g-1，表明该优选工艺稳定、可行。

3 讨论

中药成分复杂、靶点多、作用机制不明了、物质基础不明确的性质决定了单纯的化学成分指标并不能代表中药的整体性质。中药有效成分提取后药性也可能与原中药具有很大差异，因此，单纯的理化评价对中药制剂提取具有很大的局限性。药效学指标可体现制剂所含成分的综合作用，与临床作用接近，直接比较不同提取工艺产物的药效差异，对疗效更具评价力。将理化指标与药效学指标综合[11-12]，评价制剂提取工艺，使中药制剂工艺研究更具科学性和合理性。

故在双贯清感滴丸工艺研究中，根据本方的临床用途，首先结合抗流感病毒的药效学研究对复方的水提和不同浓度的乙醇提取工艺进行优选，结果表明，不同浓度的乙醇提取组药效均优于水煎组，因此本处方乙醇提取有利于药效成分的发挥，揭示生产工艺选用合适的溶剂提取以保障制剂的疗效。在此基础上，采用正交设计以理化性质的多指标综合评分优化双贯清感滴丸的醇提工艺，通过对比不同浓度乙醇提取的药效学及其有效成分的含量，发现二者存在一定的相关性，即理化性质指标绵马贯众素及金丝桃苷含量与其体现的药效学指标呈正相关性，揭示以有效成分的含量作为药效学代用指标的可能性，确保筛选出的提取工艺更合理明确。综合药效学研究及正交设计筛选提取工艺，既兼顾中药传统的应用方式，又克服中药提取仅靠理化性质出发的不足，以药效评价来确保中药提取工艺的先进性和有效性，兼顾复方指标成分提取效率及药效，对于传统中药处方的临床疗效与工艺优选具有一定指导意义。

[1] 黄永亮，吴纯洁，何晓燕.中药提取工艺评价指标的研究进展[J].中药与临床，2012，3(5)：49-52.

[2] 谢秀琼.对中药制剂工艺研究评价指标的浅见[J].中药新药与临床药理，1999，10(4)：197-198.

[3] 李罡.中药复方功效与药效学指标的相关分析[D].北京：中国中医科学院，2006.

[4] 贾晓斌，黄洋，陈斌，等.药效学结合正交试验优选通脉颗粒抗心肌缺血成分的提取工艺研究[J].中国中药杂志，2011，36(2)：154-157.

[5] 于蓓蓓，吕凌，于宗渊，等.药效学结合正交试验优选黄芩提取工艺[J].中国中药杂志，2013，38(24)：4314-4318.

[6] 肖国君，叶利明，吴纯洁，等.HPLC法测定绵马贯众中绵马贯众素的含量[J].药物分析杂志，2005，25(5)：502-504.

[7] 刘钊，安熙强，斯建勇，等.绵马贯众的活性成分研究[J].西部医学，2011，23(12)：2300-2302.

[8] 林萍，易宏伟，张斐.金丝桃苷药理作用研究进展[J].中国现代中药，2012，14(10)：23-26.

[9] 张成伟，周亚球，陈磊.金丝桃苷药理作用研究进展[J].安徽医药，2007，11(11)：961-963.

[10]杨培民，曹广尚.药效学结合正交实验优选重楼克感滴丸的提取工艺[J].中华中医药学刊，2016，34(1)：11-13.

[11]周雪梦，陆春妮，亓文宝，等.清开灵和双黄连口服液体内抗禽流感病毒作用[J].中草药，2011，42(7)：1351-1356.

ExtractionProcessofShuangguanQingganDroppingPillsBasedonOrthogonalDesignandPharmacodynamicIndex

LU Shuang1，CHENMingyue1，CAOGuangshang2*，YANGPeimin2*

(1.CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.AffiliatedhospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250011，China)

Objective：To optimize the extraction of compositions in the compound prescription of Chinese herbs of Shuangguan Qinggan dropping pills.Methods：Based on the pharmacodynamics indexes of anti-influenza virus effect，the process of water extraction and alcohol extraction with different concentrations in Shuangguan Qinggan dropping Pills was compared.Employing the content of Hyperoside and Dryocrassine as the main index ingredients to comprehensive score，the effects of ethanol concentration，solvent volume，extraction times and extraction time on the extracting process were investigated by using orthogonal design.Results：According to the pharmacodynamics indexes of anti-influenza virus with lung index and the inhibition ratio of lung index，as well as the in dex ingredients of hyperoside and dryocrassine，the optimum extraction process was as follows：adding 10 times amount of 75% alcohol，refluxing and extracting for 2 times，1 h each time.Conclusion：The extraction process with pharmacodynamics optimization shows good stability，which could ensure the therapeutic effect.

Shuangguan Qinggan dropping pills；pharmacodynamics indexes；orthogonal design；extraction process

山东省高校中医药抗病毒协同创新中心资助项目(编号：XTCX2014C-02)

] 曹广尚，主管药师，研究方向：中药制剂研发，Tel:(0531)68617919，E-mail：cgs198041@163.com；杨培民，教授、主任药师，研究方向：中药制剂研究开发，E-mail：jnypm7777@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.023

2016-09-01)

*[