新疆某羊场巴氏杆菌的分离、鉴定与药敏试验

阿依江·卡那提拜克，姚 刚，王世民

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052）

疾病防控

新疆某羊场巴氏杆菌的分离、鉴定与药敏试验

阿依江·卡那提拜克，姚 刚，王世民

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052）

为确诊新疆某羊场疑似感染巴氏杆菌羔羊的发病病源，并为其提供用药方案，对该病病原菌进行分离鉴定、动物实验、组织病理形态变化及药敏试验。结果表明：分离出的1株优势菌对小鼠具有较强的致死性，瑞士染色及生理生化鉴定致病菌为巴氏杆菌，攻毒小鼠在其组织病理形态上有不同程度的病理变化，其中肺和肝的病理变化较为显著，该致病菌对青霉素、妥布霉素、头孢噻吩钠、多粘菌素药物敏感。

巴氏杆菌；分离；鉴定；组织病理形态；药敏试验

巴氏杆菌是动物体内常见的条件致病性细菌之一，当外界因素剧烈变化或机体抵抗力下降时，常可使动物致病，严重可致动物死亡［1］。巴氏杆菌病是以高热、肺炎、急性胃肠炎及内脏广泛性出血为主要特征的一种急性、热性传染病。病原体多次通过易感动物，毒力逐渐增强，随病兽分泌物和排泄物排出的病原体经消化道和呼吸道再感染新的个体，造成大批动物发病。我国的马文戈等［2］首次从病牛组织中分离得到荚膜A型Pm巴氏杆菌。大量研究表明，巴氏杆菌是引起牛、猪等多种畜禽发生传染病的病原菌，主要引起动物发生出血性败血病或传染性肺炎［3-5］。巴氏杆菌为条件性致病菌，在正常情况下，羊场养殖环境中就可能存在该病原菌，但只有在动物机体免疫屏障受损的情况下，才能乘虚而入，侵入羊只体内，大量繁殖而导致发病［6］。因此，羊场应制定科学的保健防病方案，比如采用中草药拌料或饮水饲喂，加强饲养管理，均衡饲料全价营养物质供应，完善程序免疫，提高羊只的机体免疫力，即可有效防止内源性或外源性感染而诱发本病［7］。

本试验采集疫区羊群中染病羔羊的不同脏器组织，对疑似巴氏杆菌病进行了病原微生物的分离鉴定，并观察小鼠攻毒死亡后组织病理形态变化，还对抗菌药物的敏感性进行了研究，为当地有效防制巴氏杆菌病提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源 病料采集来源于新疆某羊场病死羊的心脏、肝脏、脾脏和肺脏等组织样本。

1.1.2 培养基 10%绵羊血琼脂平板、营养肉汤培养基。

1.1.3 主要仪器及试剂 常用新药敏纸片（产品编号C047），购于杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌生化鉴定管，购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；移液枪、接种环、PBS磷酸盐缓冲液、瑞士染色液、多功能振荡器（ST-98AB），购自北京桑翌实验仪器研究所；4℃冰箱（BCD-196F），购自青岛海尔股份有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A），购自上海齐欣科学仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-30KB），购自上海申安医疗器械厂；净化工作台（SWCJ-2FD），购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；数显恒温水浴锅（HH-S），购自江苏省金坛市医疗仪器厂；生物组织包埋机（BMJ-1），购自天津天利航空机电有限公司；电镜切片机（LKB－8800），购自瑞典LKB-BROMMA公司。

1.1.4 试验动物 健康级18 g左右KM小鼠，购自新疆医科大学试验中心。

1.2 方法

1.2.1 临床症状 观察记录。

1.2.2 细菌染色及形态观察 将无菌采集的病料预先划线接种于10%绵羊血琼脂平板上，置37℃恒温培养箱过夜培养，待长出特征性菌落，置4℃冰箱保存，备用。

1.2.3 致病菌分离培养与纯化 用新鲜病料切面在载玻片上压印制成抹片，甲醇固定2～3 min后使其自然干燥，分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，显微镜下观察细菌染色特性及形态特征。

1.2.4 生化鉴定 将分离的细菌按常规［8］方法置于无菌操作台上，于距离内容物上方2 cm处用砂条割开微型生化鉴定管，迅速用酒精灯火焰消毒，然后用接种环分别挑取分离培养所得的单菌落，进行吲哚、脲酶、鸟氨酸脱羧酶、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、海藻糖等生化发酵试验。对其进行生化鉴定并记录结果。

1.2.5 动物试验 取健康小鼠20只，分为2组，试验第1组接种细菌血清肉汤培养物，每只小鼠腹腔注射0.2 mL（100 cfu/mL）；试验第2组接种同批制作的血清肉汤作为对照，观察小白鼠发病情况。对死亡小鼠剖解，并从心血、肝、肾进行抹片及瑞士染色，显微镜形态观察，并根据王金尔等［9］方法对第1组解剖小鼠实质器官做石蜡切片，进行组织病理形态学观察。

1.2.6 药敏试验 参照文献［10］介绍的方法进行。用1 mL灭菌吸管吸取0.3 mL肉汤培养物加入90 mm平板培养基内，用涂菌棒均匀涂开，放置5 min，待培养基表面稍干后，沿平皿边缘（距皿内壁约1 cm）均匀贴上药敏纸片，每个平皿内贴上6个，37℃温箱培养24 h后测量每个药敏纸片的抑菌直径d（单位：mm）并记录。

结果判定方法为：青霉素类抑菌直径d≥28 mm为高敏感；20 mm≤d＜28 mm为中度敏感；d＜20 mm为低度敏感，d=0为不敏感。药物对其他菌株的判定标准为：d＞16 mm为高敏感，10 mm≤d＜16 mm为中度敏感，d＜10 mm为低度敏感，d=0为不敏感。

2 结果

2.1 临床症状及病理变化

羊发病后，精神沉郁，食欲废绝，咳嗽，体温升高至41～42℃。后期出现腹泻，并且混有血液。

脏器呈土黄色，肠管血便，无其他明显病理变化。

2.2 细菌培养特性及形态观察结果

病料接种营养琼脂培养基，经37℃培养24 h后，营养琼脂平板培养基上细菌生长不良；接种10%血琼脂平板培养基上，细菌生长良好，形成灰白色、圆形、微隆起、半透明、湿润、表面光滑、边缘整齐的露珠样菌落。接种血清肉汤培养基细菌生长良好，肉汤浑浊。取血琼脂平板培养基上的优势菌进行革兰氏染色镜检，呈革兰氏阴性小杆菌，两端钝圆，以单个或成双排列为主。

2.3 细菌染色及形态观察结果

分离纯化的细菌，革兰氏染色镜检，观察到革兰氏阴性小杆菌。瑞氏染色镜检，观察到两极着色的小杆菌。见图1和图2。

图1 革兰氏阴性小杆菌（100×）

图2 瑞士染色（100×）

2.4 生化试验结果

将细菌培养物接种于生化培养基，结果见表1。分离菌株与参考菌株进行比对，判定为巴氏杆菌。

2.5 动物接种试验结果

将细菌分离物接种至小鼠，第1组3只小鼠均在接种后6～8 h出现精神沉郁，被毛蓬乱，48 h内死亡，剖检无明显的病理变化。取出第1组小鼠肾脏、肝脏，直接涂片进行瑞士染色，镜检观察到两极着色的小杆菌。见图3。

表1 分离菌株的生化试验

图3 第1组小鼠肾脏瑞士染色

2.6 病理切片

做石蜡切片后在光学显微镜高倍镜下观察。肺：肺脏局部气肿，肺泡壁扩张、破裂并伴随炎性细胞浸润；肝：肝脏出现明显的局灶性坏死，肝细胞变性坏死并发生核浓缩，有成纤维细胞和巨噬细胞浸润的现象；脾：脾脏发生淋巴细胞增生，淋巴滤泡，点状坏死；肾：肾小管上皮细胞排列整齐，动脉血管壁结缔组织增厚，肾小球有萎缩变小，变性坏死及炎症现象，肾间质主要为淋巴细胞和淋巴样细胞浸润；心：心脏发生水肿，心肌纤维间质增宽，但排列较整齐，心脏发生颗粒变性（心肌纤维里面出现了很多红色的小颗粒）。见图4～8。

图4 小鼠肺脏

图5 小鼠肝脏

图6 小鼠脾脏

图7 小鼠肾脏

图8 小鼠心脏

2.7 药敏试验结果

试验共应用31种药物的药敏纸片，对分离细菌进行了耐药性测试，依照判定标准，所分离的巴氏杆菌耐药性相同，对青霉素、妥布霉素、头孢噻吩钠、多粘菌素的敏感性最强；对复方新诺明、头孢西叮、氨曲南、呋喃妥因、氨苄西林、粘菌素B、氯霉素、环丙沙星敏感性居中；对头孢他啶、克林霉素、诺氟沙星、阿米卡星、链霉素、头孢吡肟、克拉霉素、卡那霉素不敏感。见表2。

表2 巴氏杆菌对抗生素敏感性分析 mm

3 讨论

有研究表明［11-16］，动物可能因季节寒冷、环境潮湿、抵抗力下降以及营养不良导致发生巴氏杆菌病。本研究中虽然该羊场羔羊全部舍饲喂养，但因圈舍排粪板损坏，致使羔羊尿液排不出去，舍内湿度太大，再加上新疆冬天气温低，为保温加剧了圈舍的通风不良、空气污浊、氨气浓度过高，导致羔羊所处环境不良及抵抗力下降是发生这次巴氏杆菌病的主要因素。此外，该羊场在羔羊出现发病症状后没有采取及时有效的综合性防治措施，既没有改善羔羊的饲养环境条件，也没有及时通过选择敏感药物对病羊及时治疗。

小鼠脏器组织的病理变化发现，小鼠心脏水肿，肺泡壁扩张破裂，肝脏上出现局灶性坏死，腹腔内有黄色粘性液体渗出物，这些病变与巴氏杆菌在羊脏器组织上引起的病变有相同之处。

青、链霉素等抗生素曾在多年的兽医临床应用中被认为是巴氏杆菌的敏感药物和首选药物［17］。本试验结果表明，巴氏杆菌对青霉素敏感，但是对链霉素耐药性极高，这与该羊场药物使用单一，并且不进行及时治疗和用药，没有使病情得到控制有关。

4 结论

导致该羊场羔羊致病的致病菌为巴氏杆菌，其对青霉素、妥布霉素、头孢噻吩钠、多粘菌素的敏感性最强；对复方新诺明、头孢西叮、氨曲南、呋喃妥因、氨苄西林、粘菌素B、氯霉素、环丙沙星敏感性居中；对头孢他啶、克林霉素、诺氟沙星、阿米卡星、链霉素、头孢吡肟、克拉霉素、卡那霉素不敏感。

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Isolation，Identification and Sensitivity Testofthe Pathogens in a Xinjiang Sheep Farm

Ayijiang·kanatibaike，Yao Gang，Wang Shimin
（College ofVeterinary Medicine，Xinjiang AgriculturalUniversity，Urumqi830052，China）

In orderto diagnose the pathogenesis oflambs in a sheep farm in Xinjiang，and to provide a drug regimen，the pathogen isolation and identification，animal experiments，histopathological changes and drug susceptibility test were done.The results showed that one of the dominant bacteria had a strong lethal effect on mice，and the pathogenicity was similar to that of Pasteurella，and the pathologicalchanges ofthe mice were observed in differentways.The pathologicalchanges were more obvious in the lung and liver，the pathogen was sensitive to penicillin，tobramycin，cephalosporin sodium，polymyxin drugs.

Pasteurella；isolation；identification；histopathologicalmorphology；sensitivity test

S826.7

A

2095-3887（2017）05-0041-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.05.010

2017-05-23

阿依江·卡那提拜克（1991-），女，硕士研究生。

姚刚（1959-），男，教授。