唐山地区柴胡根腐病病原菌分离鉴定及生物学特性研究

唐山地区柴胡根腐病病原菌分离鉴定及生物学特性研究

姜峰1，马艳芝1，客绍英1，李小芳2
（1.唐山师范学院生命科学系，河北唐山063000；2.迁西县农牧局，河北迁西064300）

柴胡根腐病在河北唐山地区呈逐年加重趋势，严重影响了柴胡的产量和质量。为了明确唐山地区柴胡根腐病病原菌的种类，在对柴胡根腐病菌分离纯化的基础上，通过菌落形态观察与病原菌16s rDNA分析，鉴定病原菌种类，并分析了病原菌的生长特性。结果表明：通过对分生孢子等形态学观察，初步认为柴胡根腐病病原菌属镰刀菌属；应用rDNA ITS区的通用引物对病原菌基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物测序后经BLAST分析，检测结果与形态学鉴定结果一致，确定病原菌是腐皮镰刀菌（Fusarium solani）。菌丝体在PDA培养基中的最适生长温度为25℃，适宜生长pH值为6～8。致病菌孢子在30℃时萌发率最高；适宜萌发pH值为6～8；孢子在25℃水滴中2 h后开始萌发，9 h后萌发率达到100%；孢子临界致死条件为50℃、10 min。

柴胡；根腐病；病原菌；生物学特性

柴胡（Bupleurum chinense DC.）为伞形科多年生草本植物，以根入药，具有发表退热、疏肝解郁、升举阳气的功效，在临床上应用广泛，是我国常用的大宗中药材品种[1]。由于需求量巨大，市场上的柴胡主要为人工栽培[2]。山西、河北、甘肃等地区是我国柴胡的主要种植地[3]。

柴胡栽培过程中的主要病害为根腐病。根腐病为土传真菌病害，一般由1种或多种病原菌在植物根部或茎部的创伤口入侵而引发，菌丝体或孢子长期存在于土壤或植株残体中，在高温、高湿和种植密集条件下极易引起根腐病的发生。在夏季6～8月高温多雨季节，柴胡种植区的根腐病发病面积在15%～30%，在排水不畅地块发病面积高达60%以上。因此，柴胡根腐病已成为影响柴胡产量和质量的主要因素之一[4]。

李勇等[5，6]研究发现，柴胡根腐病在北京地区普遍发生，其中，1 a生柴胡病害较轻，2 a生柴胡发病较重。柴胡与小麦套种地区的根腐病发病率和病情指数均高于柴胡单独栽培区。同时还发现，同一柴胡品种在不同区域栽培，根腐病发病率和病情指数存在较大差异。说明栽培方式和环境因素对柴胡根腐病的发病率有较大影响。进一步分离柴胡根腐病致病菌，鉴定其为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），并对致病菌的生物学特性进行了研究。向琼等[4]在陕西商洛地区的柴胡种植基地调查时发现，根腐病一般在5月中、下旬开始发病，6月中旬～7月上旬为发病盛期。引起根腐病的致病菌是腐皮镰刀菌（F.solani）。对根腐病的预防措施主要是农业防治，即通过筛选抗性品种、轮作和控制水肥等方式，控制或减少病害的发生。朱再标等[7]研究发现，施用氮、钾肥会显著降低柴胡对根腐病的抗性，大量施用磷肥可以降低柴胡根腐病的病情指数；对于早期发病植株，建议采用化学杀菌剂如百菌清、甲基硫菌灵和代森锰锌等进行灌根或喷施处理[8]。

近年来，根腐病在河北唐山地区柴胡种植基地也有发生，且呈逐年加重趋势，严重影响了柴胡的产量和质量。为此，在对柴胡根腐病菌分离纯化的基础上，对其从形态学和分子生物学方面进行鉴定，以期明确唐山地区柴胡根腐病的主要致病菌及其生物学特性，为进一步的病害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

柴胡根腐病发病植株，2013年7月采自河北省唐山市玉田县柴胡种植基地。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离纯化采用组织分离法，从病株根部切取厚0.2 cm的病健交界处组织，先用5%的NaClO溶液表面消毒3 min，而后用无菌水冲洗3次，再用灭菌滤纸吸干，接种到PDA培养基上，25℃培养5 d。在无菌条件下，从菌落边缘部分挑取菌丝转接到PDA培养基上，25℃培养2～3 d，待菌丝长出后挑取菌丝进行纯化，纯化的菌种于4℃保存，待用。

1.2.2 病原菌的形态学鉴定将分离获得的候选真菌分别在PDA培养基上25℃培养7 d，观察菌落形态、颜色；用显微镜观察候选真菌分生孢子形态、隔膜有无及数目、产孢结构、厚垣孢子有无及着生部位等。

1.2.3 病原菌致病性的测定

1.2.3.1 离体接种。将纯化的菌株在PDA培养基上培养7 d后，加无菌水3 mL，制成浓度为107个/mL的孢子悬浮液。选取健康无病的1 a生柴胡根组织，先用清水冲洗干净，而后用5%的NaClO溶液表面消毒3 min，再用无菌水冲洗多次，置于灭菌的培养皿中。采用针刺法，接种孢子悬浮液100 μL，以接种等量无菌水作为对照（CK）。在温度25℃、相对湿度95%条件下培养，每处理均3次重复。

1.2.3.2 盆栽接种。选取温室内栽培的健康1 a生柴胡植株，先用清水将根部冲洗干净，而后用5%的NaClO溶液对根表面消毒3 min，再用无菌水冲洗多次，晾干后，用无菌手术刀片将根部切伤，将柴胡根部在浓度为107个/mL的孢子菌悬液中浸泡10 min后，栽植于直径20 cm的花盆中，再将孢子菌悬液灌注到根部附近的土壤中，接种量20 mL/株。以灌注无菌水作为空白对照（CK），每处理接种10株。接种后置于温室内，定期观察发病情况。

1.2.4 病原菌的分子鉴定

1.2.4.1 基因组DNA提取。柴胡致病菌在PDA培养基上25℃恒温培养7 d后，取菌丝体0.2 g，应用CTAB法提取病原菌基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

1.2.4.2 DNA-ITS区段扩增。用真核生物基因组中的rDNA-ITS区段通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增病原菌基因组DNA。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为25μL，包括：10×PCRBuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，模板DNA（约30 ng）1 μL，引物ITS1和ITS4（10 μmol/L）各1 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 18.3 μL。扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环；最后，72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，Bio-Rad凝胶成像系统观察、照相。

1.2.4.3 纯化及测序。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取凝胶中的目的条带，经琼脂糖凝胶回收试剂盒（上海生工）纯化，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4.4 同源性分析。测序结果经BLAST（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/blast）与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较，根据同源性比较结果，结合对病原菌的形态学观察及致病性测定，最终鉴定柴胡根腐病的病原菌。

1.2.5 病原菌的生长特征

1.2.5.1 温度对病原菌菌丝生长的影响。参照李勇等[6]方法，将病原菌先接种在PDA培养基上，然后分别放置于5、10、15、20、25、30和35℃的生化培养箱中培养，6 d后利用十字交叉法测量菌落直径。每处理3次重复。计算不同温度下病原菌菌丝的生长速率。

1.2.5.2 pH值对菌落生长的影响。参照李勇等[6]方法，分别用1 mol/L的HCL溶液和1 mol/L的NaOH溶液调节PDA培养基的pH值至2、4、6、8、10和12，将培养基灭菌后再接种致病菌，在25℃生化培养箱中恒温培养，6 d后测量菌落直径。每处理3次重复。计算不同pH值下病原菌的生长速率。

1.2.5.3 孢子萌发规律的研究。参照邹庆道等[9]方法，取1滴浓度为106cfu/mL的孢子水悬液滴于凹玻片的凹坑中央，然后将凹玻片放置于铺有吸水纸的培养皿中，25℃恒温保湿培养，每隔1 h随机统计100个孢子的萌发情况。每处理3次重复。计算不同时间的孢子萌发率。

1.2.5.4 温度对孢子萌发的影响。采用孢子悬滴萌发法，取浓度为106cfu/mL的病原菌孢子菌悬液100 μL滴入无菌凹玻片中，然后将凹玻片置于培养皿中，分别放置在5、10、15、20、25、30和35℃的培养箱中保湿培养24 h，在显微镜下随机统计100个孢子的萌发情况。计算不同温度下的孢子萌发率。

1.2.5.5 pH值对孢子萌发的影响。分别用1 mol/L的HCL溶液和1 mol/L的NaOH溶液调节孢子水悬液的pH值至2、4、6、8、10和12，放置于25℃培养箱中恒温保湿培养24 h，随机观察100个孢子的萌发情况。计算不同pH值下的孢子萌发率。

1.2.5.6 孢子致死温度的测定。取浓度为106cfu/mL的孢子菌悬液500 μL于1.5 mL离心管中，放置于恒温金属浴中，分别在35～70℃（其中35～50℃以5℃为间隔，51～70℃以1℃为间隔）处理10 min，之后取100 μL滴于凹玻片上，置于25℃生化培养箱中恒温培养24 h。观察孢子的萌发情况，测定孢子的致死温度。

2 结果与分析

2.1 发病情况观察

在唐山玉田地区，柴胡根腐病一般6月中下旬随着雨水增多开始发病，7月中下旬为发病盛期。当年生柴胡即有发病，如不采取措施，第2 a发病情况加重。高温、高湿、多雨年份发病重，反之，则发病较轻。根腐病主要造成柴胡根部腐烂，之后整个植株萎蔫、死亡。发病初期，柴胡根部在病原菌侵入点开始腐烂，而地上部分发病株与健康株之间无明显区别，随着根部腐烂情况的加重，在根茎交界处可以看到黑褐色病斑并逐渐扩大，更进一步根部完全腐烂，整个植株萎蔫、死亡。

2.2 菌落形态观察

分离纯化的菌株在PDA培养基上蔓延生长，气生菌丝呈白色绒毛状，不易产孢（图1）。从PDA培养基上挑取少量菌丝，镜检发现大量分生孢子和分生孢子梗。分生孢子梗伸长、不分枝；小型分生孢子长椭圆形、肾型，单胞或双胞，数量大，呈假头状聚生；大型分生孢子镰刀型，两端较钝，顶胞稍弯，具1～6隔，其中3隔膜占总数的99%以上；厚垣孢子球形，表面光滑或粗糙，顶生或间生于菌丝中（图2）。

图1 柴胡根腐病病原菌在PDA培养基上的形态学特征Fig.1 Morphological characteristic of pathogen on PDA medium

图2 柴胡根腐病病原菌不同类型的孢子Fig.2 Different types of spores

2.3 致病性检测

为了明确分离菌的致病性，首先在室内用离体根组织进行接种，结果显示，接种2 d后接种点周围开始长出白色的菌丝体，5 d后根段布满白色菌丝体并且开始腐烂；室内盆栽试验发现，接种10 d后接种部位颜色变深，之后开始逐渐扩散，更进一步根部变软，地上部分叶片逐渐卷曲、萎蔫，呈现与田间柴胡相似的发病症状。而对照均无发病症状。从发病组织重新分离病原菌，菌落和孢子形态与原接种病原菌一致。说明分离菌株为柴胡根腐病的主要致病菌。

2.4 基因组DNA提取和PCR扩增

电泳分析结果（图3）显示，病原菌基因组DNA长度＞10 kb，电泳条带清晰完整，基本没有降解。以病原菌基因组DNA为模板，用rDNA的ITS区段通用引物ITS1和ITS4扩增，得到1条400 bp左右的扩增条带。经回收、纯化及序列测定，扩增条带实际为347 bp。

图3 柴胡根腐病病原菌基因组DNA（左）和PCR产物（右）电泳结果Fig.3 Electrophoresis results of genomic DNA extraction and PCR products

2.5 PCR扩增及测序

BLAST分析结果显示，该扩增片段的核酸序列（登录号：KU747010）与Gen-Bank中F.solani对应的ITS序列同源性最高，其中，与ITS序列（KR364579、KR364574、KF986692、KF986682、KF986675）的同源性为99%。分离到的镰刀菌形态特征与腐皮镰刀菌（F.solani）基本一致。综合形态学观察、致病性测定和ITS分析结果，最终确认本研究分离的病原菌为腐皮镰刀菌。

2.6 温度对菌丝生长的影响

温度对柴胡根腐病病原菌的生长有显著影响，其中，病原菌菌丝在10～35℃温度范围内均能生长，适宜生长温度范围为25～30℃，最适生长温度为25℃；温度为5℃时，未观察到菌落生长（图4）。

图4 温度对柴胡根腐病病原菌菌丝生长的影响Fig.4 Effect of temperature on hyphal extension of pathogen

2.7 pH值对菌丝生长的影响

柴胡根腐病病原菌的菌丝在pH值2～12之间均能生长，其中，pH值＜4时，菌丝生长较为缓慢；pH值为6～8时，菌丝生长良好，菌落背面呈现暗白色（图5）。

图5 pH值对柴胡根腐病病原菌菌丝生长的影响Fig.5 Effect of pH on hyphal extension of pathogen

2.8 病原菌孢子萌发规律

25℃条件下，柴胡根腐病病原菌分生孢子2 h后开始萌发，6 h后萌发率达到88%，9 h后全部萌发（图6）。

2.9 温度对孢子萌发的影响

温度对柴胡根腐病病原菌孢子萌发具有显著影响，其中，30℃条件下病原菌孢子萌发率最高，且与其他温度处理差异均达到了显著水平（表1），表明柴胡根腐病病原菌孢子萌发的最适温度为30℃。而温度≤10℃时，孢子均不萌发；温度＞30℃时，孢子萌发率又显著降低。

图6 柴胡根腐病病原菌孢子的萌发规律Fig.6 Characteristics of spore germination

表1 温度对柴胡根腐病病原菌孢子萌发的影响（%）Table 1 Effect of temperature on spore germination

2.10 pH值对孢子萌发的影响

pH值对柴胡根腐病病原菌孢子萌发有显著影响，其中，pH值为8条件下病原菌孢子萌发率最高，其次是pH值为6处理，二者孢子萌发率为94%~95%且差异不显著（表2），表明柴胡根腐病病原菌孢子萌发的适宜pH值为6～8。而pH值＜6或＞10时，孢子萌发率均显著降低（表2）。

表2 pH值对柴胡根腐病病原菌孢子萌发的影响（%）Table 2 Effect of pH on spore germination

2.11 孢子的临界致死温度

柴胡根腐病致病菌孢子在温度35～45℃条件下均可萌发，但是萌发率随着温度的升高而降低，其中，温度＞45℃时分生孢子不能萌发，延长培养时间，仍然未见到孢子萌发（图7）。表明柴胡根腐病孢子的临界致死温度为50℃，高温处理后分生孢子无萌发现象。

图7 柴胡根腐病分生孢子的临界致死温度Fig.7 Spore critical lethal temperature

3 结论与讨论

近年来，由于中药市场需求持续增长和仿野生栽培技术的推广，中药材种植面积迅速扩大，同时其病害问题也日益突出。根茎类中药材由于经济部位是根茎部，因此根腐病严重影响该类中药材的产量和质量。根腐病在三七[10]、黄芪[11，12]、板蓝根[13]、丹参[14，15]、川芎[16，17]等中药材种植基地均有不同程度的发生。

引起中药材根腐病的致病菌主要是镰刀菌属真菌，其中，以尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌分离报道频率较高[18]。李勇等[5]从北京地区的发病柴胡中分离并鉴定根腐病致病菌为尖孢镰刀菌。而向琼等[4]认为柴胡根腐病是由腐皮镰刀菌引起。本研究通过形态学和分子鉴定，并经过回接验证，确认引起河北唐山地区柴胡根腐病的致病菌是腐皮镰刀菌。这说明，不同地区的柴胡根腐病是由不同的致病菌引起。因此，更需要对不同地区的柴胡根腐病致病菌进行分离鉴定。

本研究中对柴胡根腐病菌丝体生长和孢子萌发条件进行了探索，结果表明，病原菌在PDA培养基上10～35℃条件下均能生长，最适生长温度为25℃。在一定的温度范围内，升高温度对菌丝生长有促进作用，温度越高，菌丝生长越快；但过高温度会对菌丝生长产生抑制作用，温度超过30℃时菌丝生长速率急剧下降。病原菌生长适宜pH值为6～8。pH值为6～12时，病原菌菌丝生长相对较快，说明病原菌适宜在中性稍偏碱性的环境中生长。病原菌孢子在适宜的条件下2 h即开始萌发，9 h后全部萌发，且孢子在较为宽泛的温度和pH值条件下均能很好地萌发，说明病原菌有较强的生命力。在唐山柴胡种植基地观察发现，根腐病一般6月中下旬随着雨水增多开始发病，7月中下旬为发病盛期。这期间当地平均气温为20～30℃，且全年降水也主要集中在6～8月，这种条件正适合柴胡根腐病病原菌的生长、产孢和萌发，也正是该时期柴胡根腐病高发的重要原因。

柴胡根腐病菌在适宜的条件下能够快速生长繁殖，一旦发病，难于控制。因此，对柴胡根腐病的控制应以预防为主，定期检查土壤及柴胡根际致病镰刀菌的情况，及时采取措施，预防病害的发生，从而提高柴胡的质量和产量，促进种植户增产增收。

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Identification and Biological Characteristics of Root Rot Pathogen of Bupleurum chinense DC. in Tangshan Area

JIANG Feng1，MA Yan-zhi1，KE Shao-ying1，LI Xiao-fang2
（1.Life Science Department of Tangshan Normal University，Tangshan 063000，China；2.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Qianxi，Qianxi 064300，China）

Plate dilution method were used to identification of root rot pathogen of Bupleurum chinense DC.in Tangshan area，and pathogenicity was test through in vivo and in vitro experiments.The pathogen was preliminarily identified as Fusarium spp.according to its morphology，color and growth rate of the colonies，and morphology of macroconidia，microconidia，chlamydospores，and conidiophores．The fungal rDNA ITS was amplified and sequenced．The sequencing results was accepted by GenBank and the accession number is KU747010．The results of molecular detection and morphologic observation both showed that the pathogens causing root rot of Bupleurum chinense DC. is Fusarium solani．Pathogens optimum grow temperature and pH value were 25℃and 6-8，respectively.Under the environment of 25℃，the spore began to germinate in 2 hours and germination rate reached 100%after 9 hours. The killing conditions of spore were 50℃，10 min.

Bupleurum chinense DC.；Root rot；Pathogen；Biological characteristics

S435.672

A

1008-1631（2017）03-0045-06

2016-11-30

国家科技支撑计划子课题项目（2011BAI07B05-4）；河北省科学技术厅项目（15456420）；唐山市科学技术局项目（15130265a）

姜峰（1976-），男，黑龙江宁安人，副教授，博士，主要从事药用植物土传病害生物防治研究。Tel：0315-3863212；E-mail：foodman307@163.com。