小花棘豆中毒对家兔睾丸和附睾中SOD表达的影响

王帅，刘奇凡，刘登旺，陈根元，张玲

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

小花棘豆中毒对家兔睾丸和附睾中SOD表达的影响

王帅，刘奇凡，刘登旺，陈根元，张玲

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

【目的】研究小花棘豆毒性成分对家兔睾丸、附睾组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及基因表达的影响。【方法】将48只雄性家兔随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，试验组分别按照Ⅰ组15%(苦马豆素含量30 mg/kg)、Ⅱ组30%(苦马豆素含量60 mg/kg)、Ⅲ组45%(苦马豆素含量90 mg/kg)的比例添加小花棘豆，对照组仅饲喂苜蓿干草，试验期70 d。分别于攻毒后第14、35、70 d每次每组随机采集4只家兔的睾丸和附睾组织，通过羟胺法检测SOD活性的变化，real-time PCR检测SOD mRNA的表达，免疫组化和Western Blot检测SOD蛋白的表达。【结果】从第35 d开始，与对照组相比，各试验组家兔附睾、睾丸中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均极显著下降(P﹤0.01)，mRNA表达量和蛋白表达量均呈现出明显的下降趋势，而且其差异性随中毒时间的延长而变化。【结论】小花棘豆中毒可导致家兔睾丸、附睾中SOD活性与表达异常，且与小花棘豆中毒呈现一定的时间-剂量效应。

小花棘豆；家兔；睾丸；附睾；超氧化物歧化酶

0 引 言

【研究意义】小花棘豆(OxytropisglabraDC)是新疆南疆地区分布广泛，危害严重的有毒植物，放牧家畜在冬季及初春因饲草不足而被迫大量采食从而导致中毒，其中约50%的中毒家畜死亡[1]。中毒家畜主要表现为繁殖机能障碍，研究表明中毒动物的卵巢、睾丸等器官指数均极显著高于对照组，且均与小花棘豆中毒极显著相关，目前放牧家畜小花棘豆中毒已严重危害南疆地区草原畜牧业的发展[2]。【前人研究进展】研究表明，小花棘豆中毒可通过影响高尔基体和溶酶体中的α-甘露糖苷酶的活性与表达，造成细胞中甘露糖蓄积，从而导致细胞损伤[3,4]，进一步研究表明其可通过影响细胞中p53、Bcl-2和Bax的表达导致细胞凋亡，而且这种损伤作用与中毒动物抗氧化机能受损有关[5]。研究发现[6-8]小花棘豆中毒导致的动物细胞空泡变性与自由基引起的空泡变性有一定的相似性，而且中毒动物表现为抗氧化酶活性下降，自由基含量升高，血液运氧能力严重受损，表明小花棘豆毒性成分可显著影响动物机体的抗氧化机能。【本研究切入点】超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是动物机体清除体内自由基、降低脂质过氧化的重要酶之一。根据SOD结合金属离子的不同，将其分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD、Fe/Zn-SOD和Fe/Mn-SOD 6种类型，其中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD在细胞中广泛存在，是维持氧自由基平衡的重要金属酶。但目前有关小花棘豆毒性成分对动物机体抗氧化酶表达的影响未见报道。研究小花棘豆毒性成分对家兔睾丸、附睾组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及基因表达的影响。【拟解决的关键问题】研究小花棘豆中毒家兔睾丸及附睾中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD mRNA及蛋白表达的变化，明确小花棘豆中毒对雄性家兔繁殖器官的损伤机制，为动物小花棘豆中毒的防治提供。

1 材料与方法

1.1 材 料

小花棘豆采自和田地区策勒县，取地上部分，样品为风干样。

总SOD(T-SOD)检测试剂盒，SOD分型(Cu/Zn、Mn)试剂盒，南京建成生物科技有限公司；家兔SOD抗性一抗，英国Abcam；SABC免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，博士德公司；总RNA提取试剂盒，Real-time q PCR试剂盒， TAKARA(大连)有限公司。

5810R型高速冷冻离心机，5331型PCR仪，Realplex2型实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorff；CX31型生物显微镜，日本Olympus； DSC型切片机，HI1220型温控烤片台，德国Leica；Trans-Blot Turbo型半干转膜仪，美国BIO-RAD公司。

1.2 方 法

1.2.1 动物分组与处理

雄性家兔48只，体质量(2.0±0.1) kg，平均分为对照组和3个试验组，分笼饲养。对照组仅饲喂青苜蓿干草，3个试验组分别饲喂掺入小花棘豆15%、30%和45%(按气相色谱法计算苦马豆素含量分别为30、60和90 mg/kg[9])的混合干草，试验期70 d。试验第14 d、第35 d和第70 d各组分别剖杀4只家兔取睾丸及附睾，部分组织匀浆后检测SOD活性，部分组织于Bouin’s 液固定后进行免疫组化染色，部分组织用于Real-time PCR和Western Blot检测。

1.2.2 小花棘豆中毒家兔睾丸、附睾中SOD活性的检测

将家兔睾丸、附睾组织按1∶9(m/v)制备组织匀浆液，1 500 r/min离心后取上清，按照检测试剂盒说明书步骤加入试剂，涡旋混匀，37℃孵育40 min，加入显色剂显色后静置10 min，检测OD550值。

1.2.3 Real-Time q PCR检测小花棘豆中毒家兔睾丸、附睾中SODmRNA表达水平

试验所用引物参考GenBank中公布的家兔T-SOD、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和β-actin基因序列，利用Beacon Designer软件设计，引物由TAKAEA(大连)有限公司合成，引物信息见表1。利用试剂盒提取家兔睾丸及附睾细胞总RNA，然后进行反转录，反应体系如下：RT Primer Mix 1.0 μL，Prime Script®RT Enzyme Mix I 1.0 μL，Prime Script®Buffer 5× 4.0 μL， RNA提取液10.0 μL，ddH2O 4.0 μL，合计20.0 μL；反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。Real-time q PCR反应体系如下：SYBR®Premix ExTaqTM 2× 10.0 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ROX Reference Dye II 50× 0.4 μL，cDNA液2.0 μL，RNase Free dH2O 6.0 μL，合计20.0 μL；反应条件为95℃预变性30 s， 95℃变性5 s，60℃退火34 s，反应40个循环。表1

表1 引物设计

Table 1 Primer design

项目Item引物和探针序列(5＇-3＇)Primerandprobesequence(5＇-3＇)产物大小(bp)Sizeofproduct(bp)GeneBank登录号AccessionNo．T-SOD上游(Upstream)：AATGCCCGCCAAAGCAGTT下游(Downstream)：TTAAATCTTGGCCAAGCCAAT497BC002066Cu/Zn-SOD上游(Upstream)：GAGCCTTTCCCCCGAGTCAT下游(Downstream)：GTTCACCTTCAGTCAGCCCT152FJ546075Mn-SOD上游(Upstream)：GTGGGCCGCTCTAGGCACCA下游(Downstream)：CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG245NM＿017050β-actin上游(Upstream)：ATTAACGCGCAGATCATGCAG下游(Downstream)：TTTCAGATAGTCAGGTCTGACGTT483X02231

1.2.4 免疫组化检测小花棘豆中毒家兔睾丸、附睾中SOD蛋白表达

常规石蜡包埋家兔睾丸和附睾组织，切片厚度0.5 μm，然后按照试剂盒说明书，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，甲醇-H2O2处理，抗原修复，胎牛血清封闭，加入兔抗性一抗，加入鼠抗兔二抗，加入SABC复合物反应后进行DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，中性树胶封片。同时以 PBS取代一抗作为阴性对照，镜检观察。

1.2.5 Western Blot检测小花棘豆中毒家兔睾丸、附睾中SOD蛋白表达水平

提取家兔睾丸和附睾组织中的蛋白，采用4%的浓缩胶和15%的分离胶，样品中加入1/5体积的5×Loading buffer，煮沸 10 min，SDS-PAGE电泳后将膜蛋白转移到 NC 膜上，TBST稀释脱脂奶粉封闭1 h，一抗孵育(4℃)过夜，PBST洗涤后二抗避光孵育1 h(室温)，PBST 洗涤后ECL显色，拍照。

1.3 数据处理

试验数据使用SPSS 16.0软件中One-Way ANOVA方法进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1小花棘豆中毒对家兔睾丸、附睾中SOD活性的影响

小花棘豆攻毒可导致家兔睾丸、附睾组织中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性显著下降。第14 d时试验I组和试验II组家兔睾丸、附睾组织中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均显著低于对照组(P<0.05)，试验III组家兔睾丸、附睾组织中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均极显著低于对照组(P<0.01)；第35 d时和第70 d时所有试验组家兔睾丸、附睾组织中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均极显著低于对照组(P<0.01)。小花棘豆毒性成分可显著影响家兔睾丸、附睾组织中的SOD酶活性。表2，表3

2.2小花棘豆中毒对家兔睾丸、附睾组织中T-SOD基因表达的影响

研究表明，各试验组家兔睾丸、附睾组织中T-SOD均有表达。第14 d时试验I组和试验Ⅱ组家兔睾丸、附睾组织中T-SODmRNA表达量均显著低于对照组(P﹤0.05)，但试验III组家兔睾丸、附睾组织中T-SODmRNA表达量均极显著低于对照组(P﹤0.01)；试验第35 d起所有试验组家兔睾丸、附睾组织中T-SODmRNA表达量均极显著低于对照(P﹤0.01)。表4，表5

表2 家兔睾丸组织中SOD活性的变化(U)

Table 2 Effects of contents of SOD in testis tissue of rabbits

时间Time对照组Controlgroup试验I组TestgroupI试验II组TestgroupII试验III组TestgroupIIIT-SOD活性ContentofT-SOD14d63 72±2 93Aa52 61±3 51ABb47 24±4 45ABbc40 02±3 57Bc35d65 28±4 01Aa43 26±4 49Bb40 37±3 66Bbc33 32±4 73Bc70d65 17±2 41Aa36 20±3 06Bb31 41±3 83Bb28 56±2 01BbCu/Zn-SOD活性ContentofCu/Zn-SOD14d37 15±2 26Aa27 78±2 33ABb26 04±2 14ABb24 32±2 31Bb35d38 86±3 17Aa20 55±2 08Bb18 98±1 98Bb16 02±2 11Bb70d36 65±2 54Aa19 86±2 13Bb15 31±1 37Bbc10 34±1 53BcMn-SOD活性ContentofMn-SOD14d22 45±2 87Aa15 31±1 72ABb14 99±1 63ABb13 72±1 27Bb35d22 26±2 53Aa13 56±1 38Bb12 23±1 58Bbc8 56±1 13Bc70d21 77±2 34Aa13 10±1 41Bb11 81±1 70Bbc8 02±1 28Bb

注: 同行数据小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，下同

Note： The difference between data in the same row with the different lowercase letters is significant(P<0.05), and difference between data with the different uppercase letters is very significant(P<0.01),the same as follow

表3 家兔附睾组织中SOD活性变化

Table 3 Effects of contents of SOD in epididymis tissue of rabbits

时间Time(d)对照组Controlgroup试验I组TestgroupI试验II组TestgroupII试验III组TestgroupIIIT-SOD活性ContentofT-SOD1455 08±3 14Aa44 86±2 85ABb40 71±3 55ABb37 62±2 74Bb3555 62±3 79Aa31 36±3 04Bb32 03±3 76Bb21 22±2 58Bc7055 27±3 65Aa29 85±2 11Bb25 56±2 32Bbc18 46±1 77BcCu/Zn-SOD活性ContentofCu/Zn-SOD1428 96±2 33Aa19 09±2 14ABb18 54±2 96ABb16 44±1 75Bb3526 25±2 76Aa15 36±1 79Bb14 12±1 66Bb12 12±1 51Bb7029 31±2 63Aa14 86±1 73Bb13 71±1 57Bb7 94±1 28BcMn-SOD活性ContentofMn-SOD1420 21±1 97Aa12 42±1 36ABb12 51±1 73ABb11 02±1 43Bb3521 06±2 25Aa10 85±1 26Bb10 03±1 41Bb8 63±1 35Bb7019 66±2 59Aa9 74±1 15Bb8 83±0 97Bb7 62±0 55Bb

表4 家兔睾丸T-SOD基因mRNA相对表达量变化

Table 4 Effects of relative expression of T-SOD mRNA in testis tissue of rabbits

时间Time(d)对照组Controlgroup试验I组TestgroupI试验II组TestgroupII试验III组TestgroupIII140 0223±0 0069Aa0 0171±0 0047ABb0 0159±0 0063ABb0 0143±0 0072Bb350 0226±0 0071Aa0 0132±0 0067Bb0 0128±0 0054Bb0 0100±0 0036Bb700 0219±0 0068Aa0 0113±0 0044Bb0 0094±0 0026Bb0 0085±0 0024Bb

表5 家兔附睾T-SOD基因mRNA相对表达量变化

Table 5 Effects of relative expression of T-SOD mRNA in epididymis tissue of rabbits

时间Time(d)对照组Controlgroup试验I组TestgroupI试验II组TestgroupII试验III组TestgroupIII140 0191±0 0054Aa0 0135±0 0022ABb0 0122±0 0028ABb0 0115±0 0042Bb350 0186±0 0037Aa0 0111±0 0017Bb0 0104±0 0024Bb0 0096±0 0019Bb700 0193±0 0060Aa0 0105±0 0015Bb0 0093±0 0016Bb0 0083±0 0014Bb

2.3小花棘豆中毒对家兔睾丸、附睾组织中Cu/Zn-SOD基因表达的影响

研究表明，第14 d时试验I组和试验II组家兔睾丸、附睾组织中Cu/Zn-SODmRNA表达量均显著低于对照组(P﹤0.05)，但试验III组家兔睾丸、附睾组织中Cu/Zn-SODmRNA表达量均极显著低于对照组(P﹤0.01)；试验第35 d起所有试验组家兔睾丸、附睾组织中Cu/Zn-SODmRNA表达量均极显著低于对照(P﹤0.01)。表6，表7

表6 家兔睾丸Cu/Zn-SOD基因mRNA相对表达量变化

Table 6 Effects on relative expression of Cu/Zn-SOD mRNA in testis tissue of rabbits

时间Time(d)对照组Controlgroup试验I组TestgroupI试验II组TestgroupII试验III组TestgroupIII140 0112±0 0031Aa0 0080±0 0012ABb0 0073±0 0013ABb0 0061±0 0012Bb350 0119±0 0029Aa0 0062±0 0017Bb0 0057±0 0014Bb0 0050±0 0013Bb700 0117±0 0036Aa0 0056±0 0020Bb0 0049±0 0016Bb0 0038±0 0010Bb

表7 家兔附睾Cu/Zn-SOD基因mRNA相对表达量变化

Table 7 Effects of relative expression of Cu/Zn-SOD mRNA in epididymis tissue of rabbits

时间Time(d)对照组Controlgroup试验I组TestgroupI试验II组TestgroupII试验III组TestgroupIII140 0097±0 0022Aa0 0062±0 0016ABb0 0057±0 0014ABb0 0051±0 0017Bb350 0096±0 0027Aa0 0053±0 0017Bb0 0044±0 001Bb0 0040±0 0012Bb700 0097±0 0031Aa0 0051±0 0015Bb0 0043±0 0013Bb0 0038±0 0011Bb

2.4小花棘豆中毒对家兔睾丸、附睾组织中Mn-SOD基因表达的影响

试验第14 d时试验I组家兔睾丸、附睾组织中Mn-SODmRNA表达量与对照组差异不显著(P>0.05)，试验II组Mn-SODmRNA表达量显著低于对照(P﹤0.05)，试验III组Mn-SODmRNA表达量极显著低于对照(P﹤0.01)；试验第35 d和第70 d时小花棘豆攻毒家兔睾丸、附睾组织中Mn-SODmRNA表达量均极显著低于对照(P﹤0.01)。研究表明，小花棘豆毒性成分可显著降低SOD基因的表达，影响机体自由基代谢对照。表8，表9

表8 家兔睾丸Mn-SOD基因mRNA相对表达量变化

Table 8 Effects on relative expression of Mn-SOD mRNA in testis tissue of rabbits

时间Time(d)对照组Controlgroup试验I组TestgroupI试验II组TestgroupII试验III组TestgroupIII140 0075±0 0029Aa0 0061±0 0017ABab0 0052±0 0016ABbc0 0039±0 0012Bc350 0072±0 0024Aa0 0038±0 00015Bb0 0031±0 0014Bbc0 0025±0 0006Bc700 0074±0 0022Aa0 0033±0 0009Bb0 0024±0 0010Bb0 0021±0 0006Bb

表9 家兔附睾Mn-SOD基因mRNA相对表达量变化

Table 9 Effects of relative expression of Mn-SOD mRNA in epididymis tissue of rabbits

时间Time(d)对照组Controlgroup试验I组TestgroupI试验II组TestgroupII试验III组TestgroupIII140 0083±0 0025Aa0 0065±0 0020ABab0 0052±0 0017ABbc0 0042±0 0014Bc350 0082±0 0017Aa0 0041±0 0013Bb0 0034±0 0012Bb0 0029±0 0007Bb700 0079±0 0023Aa0 0035±0 0008Bb0 0028±0 0006Bb0 0023±0 0004Bb

2.5免疫组化法检测小花棘豆中毒家兔睾丸、附睾中SOD基因蛋白定位

SOD基因蛋白定位结果显示，对照组家兔睾丸和附睾头、附睾体、附睾尾均检测到SOD蛋白表达，其中家兔睾丸管腔上皮细胞、间质细胞、精原细胞(图1A)和附睾体假复层上皮细胞、附睾头管腔假复层上皮细胞、附睾尾单层柱状上皮细胞(图1D)均有极为强烈的阳性表达。小花棘豆攻毒后可见试验I组家兔睾丸细胞的胞质内含部分浅蓝色的SOD阳性细胞，其多分布于靠近曲精细管管壁部(图1B)，而试验II组和试验III组家兔睾丸细胞中SOD蛋白颗粒数量减少，几乎只分布于曲精细管的管壁部分(图1C)。与对照组相比，小花棘豆攻毒组家兔附睾中SOD阳性细胞几乎完全消失(图1E；图1F)。研究表明，小花棘豆毒性成分可导致家兔睾丸、附睾中SOD蛋白表达下降，而且这种趋势在中、高剂量组中尤为明显。图1

图1 SOD蛋白在对照家兔(A), 小花棘豆中毒家兔(B、C)睾丸组织及对照家兔(D), 小花棘豆中毒家兔(E、F)附睾组织中的分布

Fig.1 Distributions of SOD of testis in control group (A) and O. glabra poisoning groups (B,C), SOD of epididymis in control group (D) and O. glabra poisoning groups (E,F)

2.6 Western Blot检测小花棘豆中毒家兔睾丸、附睾中SOD基因蛋白表达

Western Blot显示，与对照家兔相比，第14 d时试验I组与试验II组家兔睾丸、附睾中SOD蛋白表达均显著低于对照(P<0.05)，试验III组家兔睾丸、附睾中SOD蛋白表达极显著低于对照(P<0.01)；第35 d和第70 d时所有试验组家兔睾丸、附睾中SOD蛋白表达均极显著低于对照(P<0.01)。小花棘豆毒性成分可显著影响家兔睾丸、附睾中SOD蛋白表达量，而且与剂量呈现出一定的相关性。图2～4

注：*表示与对照组比较，P<0.05；**表示与对照组比较，P<0.01，下同

Note：*Compared with control group,P<0.05;**Compared with control group,P<0.01,the same as follow

图2 小花棘豆中毒家兔睾丸中SOD蛋白表达变化

Fig.2 The change of O.glabra poisoning on the expression of SOD in testis of rabbits

图3 小花棘豆中毒家兔附睾中SOD蛋白表达变化

Fig.3 The change of O.glabra poisoning on the expression of SOD in epididymis of rabbits

注：1对照组睾丸；2试验I组睾丸；3试验II组睾丸；4试验III组睾丸；5对照组附睾；6试验I组附睾；7试验II组附睾；8试验III组附睾

Note： 1 Testis in control group; 2 Testis in test group I; 3 Testis in test group II; 4. Testis in test group III; 5 Epididymis in control group; 6 Epididymis in test group I; 7 Epididymis in test group II; 8 Epididymis in test group III

图4 小花棘豆攻毒下家兔睾丸、附睾中SOD蛋白表达

Fig.4 Effects of O.glabra poisoning on the expression of SOD in testis and epididymis of rabbits

3 讨 论

SOD广泛分布于动物体各组织中，是消除超氧阴离子毒性效应的最重要的酶，目前研究认为SOD可维护动物机体内环境的稳定，以及快速的、特异性的消除O2-对机体细胞的损伤，任何利用氧的机体没有SOD或相当的保护机制是不能生活[10]。试验研究发现，小花棘豆中毒可导致家兔睾丸、附睾中SOD酶活性、基因mRNA表达量和蛋白表达量下降，而且这种变化趋势与小花棘豆饲喂量相关。任有蛇等[11]研究发现动物睾丸、附睾中SOD活性极低时可导致动物不孕不育。张春香等[12]通过添加外源性物质提高了动物附睾中的SOD活性，有效延长了精液保存时间，并提高了动物受精率。国内外研究发现小花棘豆中毒可导致雄性家畜精子数量降低，精子畸形率显著升高，从而造成繁殖机能下降，可能与小花棘豆毒性成分导致的繁殖器官抗氧化酶活性下降有关。

Cu/Zn-SOD是动物机体中一种重要的抗氧化酶，可有效清除机体超氧自由基，繁殖器官中的Cu/Zn-SOD可保护精子免受脂质过氧化物的损伤，维持精子形态和功能正常[13]。目前有关植物毒性成分对雄性动物繁殖器官中Cu/Zn-SOD影响的研究较少，早期研究认为Cu/Zn-SOD分布于睾丸间质细胞的胞浆、精子滑面内质网膜及顶体，并在附睾头、附睾体和附睾尾中均有分布[14]。试验研究发现，小花棘豆中毒可显著抑制Cu/Zn-SOD酶活性、基因 mRNA表达量和蛋白表达量，并导致其在动物睾丸、附睾中的分布减少，结果表明，小花棘豆毒性成分可显著影响Cu/Zn-SOD酶的翻译、转录与表达。张春香等[12]研究发现Cu/Zn-SOD酶活性与精液中精子数量、精子活力、精子密度和质膜完整性呈正相关，与精子畸形率呈负相关。Waheed等[15]研究认为Cu/Zn-SOD酶对精子发生过程中的精原细胞有重要的保护作用。研究发现[5]小花棘豆中毒导致家兔睾丸精原细胞凋亡率极显著升高，可能与睾丸中Cu/Zn-SOD酶的活性极低相关。

哺乳动物体内的SOD主要有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD，二者合成不足或者功能缺陷，都将导致体内氧化抗氧化系统失衡。目前研究认为Cu/Zn-SOD主要是清除在类固醇合成时产生的超氧游离基清除剂[16]，Mn-SOD则是在儿茶酚胺合成时的超氧游离基清除剂[17]。试验研究发现，小花棘豆中毒可影响家兔睾丸、附睾中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的翻译、转录与表达，而且对Cu/Zn-SOD的影响较为显著；可能与合成和分泌过多的不同激素所产生的超氧游离基堆积有关。小花棘豆中毒对机体抗氧化信号转导通路的作用以及细胞内氧化还原状态的改变，还需要进一步的研究探索。

4 结 论

小花棘豆中毒可显著影响家兔睾丸与附睾组织中SOD酶的活性与表达，攻毒35 d后，小花棘豆中毒家兔睾丸、和附睾组织中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均极显著低于对照(P<0.01)，T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SODmRNA表达量和蛋白表达量均极显著低于对照(P<0.01)。小花棘豆中毒可导致家兔睾丸、附睾抗氧化能力下降，从而导致其繁殖机能损伤。

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EffectsofOxytropisglabraDCPoisoningonExpressionofSuperoxideDismutaseinTestisandEpididymisofRabbits

WANG Shuai, LIU Qi-fan, LIU Deng-wan, CHEN Gen-yuan, ZHANG Ling

(CollegeofAnimalScience,TarimUniversity/KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionCorps,AlarXinjiang843300,China)

【Objective】 The aim of this study was to investigate the effects ofOxytropisglabra(O.glabra) DC poisoning on the activity and expression of the superoxide dismutase (SOD) gene in rabbit testis and epididymis.【Method】48 male rabbits were randomly divided into blank control group and experimental group I, II and III. The dried plant ofO.glabraDC was comminuted, then different amounts of the grass powder (15%, 30% and 45% and the corresponding swainsonine content was 30, 60, 90 mg/kg) were mixed with the forage in 3 experimental groups. The rabbits consumed the forages freely until typical symptoms were observed; the test period was 70 d. 4 rabbits were selected randomly from each group on the 14 th, 35 th and 70 th day respectively; the testis and epididymis were collected. The activity of SOD was measured by hydroxylamine method, the mRNA expression was measured by real-time quantitative polymerase chain reaction (real-time PCR), the level of SOD protein expression was measured by immunohistochemical staining and Western Blot.【Result】The activity of SOD was measured by hydroxylamine method, the mRNA expression was measured by real-time quantitative polymerase chain reaction (real-time PCR), the level of SOD protein expression was measured by immunohistochemical staining and Western Blot. The result showed that the activity of SOD, the expression of SOD mRNA and protein decreased in poisoning rabbits testis and epididymis were very significant lower than that of the control group (P<0.01) form 35 th day.【Conclusion】The results showed thatO.glabraDC has remarkable effects on the expression of SOD mRNA and protein in rabbit testis and epididymis, presenting a certain time dose effect. The activity and expression change in SOD is highly associated withO.glabraDC poisoning and it may play an important role in this process.

short ultivars; growth stages; major gene plus polygene inheritance; genetic analysis

Zhang Ling(1966-), female, native place:Hejian, senior experimentingist, regular college course, Hebei, research field: Grassland ecology.(E-mail)1044763025@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.021

2017-06-06

国家自然科学基金项目“小花棘豆中毒对和田羊抗氧化机能的影响机制”(31460678)

王帅(1984-)，男，山西长治人，高级实验师，硕士，研究方向为动物中毒病及毒理学，(E-mail)wangshuaidky@126.com

张玲(1966-)，女，河北河间人，高级实验师，研究方向为草地生态学，(E-mail)1044763025@qq.com

S856.9

：A

：1001-4330(2017)08-1540-10

Supported by: National Natural Science Foundation of China "Mechanisms of Antioxidant Ability in Hotan Sheep by Poisoning of Oxytropis glabra DC"( 31460678)