山羊痘病毒PCR检测方法的建立及应用

白艳艳,张 斌,郝玉青 ,高 艳,刘万华,白崇生,刘健鹏*,韩 斌，杨德全

(1.榆林市动物疫病预防控制中心,陕西榆林 719000；2.榆林市动物卫生监督所,陕西榆林 719000；3.上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

山羊痘病毒PCR检测方法的建立及应用

白艳艳1△,张 斌2△,郝玉青1,高 艳1,刘万华1,白崇生1,刘健鹏1*,韩 斌1，杨德全3

(1.榆林市动物疫病预防控制中心,陕西榆林 719000；2.榆林市动物卫生监督所,陕西榆林 719000；3.上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

为了更快、更准确的诊断山羊痘(Goat pox)，根据GenBank上已公布的山羊痘病毒(GTPV)的基因序列，针对p32基因的保守序列设计并合成一对能特异性扩增山羊痘病毒的引物，扩增产物大小约为983 bp。经过反应条件的优化，建立了山羊痘病毒PCR检测方法，对所建立的PCR反应体系的特异性和灵敏性进行了评价，并用此方法对9份临床样品进行了检测。结果显示,该诊断方法与3种非羊痘病毒不发生交叉反应。该方法最低浓度检测限为0.4 pg。在检测的临床样品中，GTPV阳性有3 份。结果表明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性，适合临床诊断应用。

山羊痘；聚合酶链反应；敏感性；特异性

山羊痘(Goat pox)是由山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)引起的一种以发热、无毛或少毛部位皮肤出现痘疹为特征的急性、热性、高度接触性传染病，在世界许多国家和地区发生和流行，造成巨大的经济损失。被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[1-4]。

近年来，山羊痘主要发生在我国的山东、内蒙古、黑龙江、甘肃、宁夏、青海等省区，呈地方流行特点，危害很大，严重影响养羊业的发展[5]。榆林市是陕西省主要养羊区，养殖量占全省总量的60%，以养殖陕北白绒山羊为主，其养殖量占陕西省总量的90%以上，羊绒产量占全省总量的93%，白绒山羊养殖已经成为榆林市农村农民的主要收入来源。近年来，由于榆林市养羊数量的增加，与此同时疫病的发生也有所增加，有些县区时有羊痘的发生，给我市养羊业的发展带来了极大的损失。由于榆林地区实验室条件及诊断方法相对落后，对陕北白绒山羊羊痘诊断主要依靠临床症状进行判断，易造成误诊。因此，急需建立适合本地区实验室条件的检测方法。本研究针对羊痘病毒P32基因序列中保守的区域设计引物，建立了快速检测羊痘病毒核酸的PCR，为实验室诊断提供科学准确的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与病料 羊痘疫苗(批号：201609)，哈药集团生物疫苗有限公司产品；羊痘疑似病料样品共9份(全血，血清和痘痂样品各3份)。

1.1.2 试剂 PCR Pre-mix、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit ver.4.0，宝生物工程(大连)有限公司产品； DNA Marker，南京上高生物公司产品；引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据参考文献[6-7]以及GenBank中公布的山羊痘病毒p32基因序列，应用Primer 5.0引物设计软件，设计一对特异性引物，预期扩增片段大小为983 bp。上游引物CACCGAATTCACCATGGCAGATATCCCATTATAT；下游引物GATGGCGGCCGCAACTATATACGTAAATAAC；用ddH2O稀释到25 pmol/L， 置-20 ℃保存备用。

1.2.2 山羊痘 DNA的提取 取200 μL羊痘疫苗悬液，按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit ver.4.0试剂盒说明书，提取山羊痘病毒基因组DNA。提取的DNA置-20℃保存。

1.2.3 PCR扩增 将提取的DNA进行PCR扩增，反应体系为25 μL，其中PCR Pre-mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，补足ddH2O至25 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min； 94℃ 1 min，50℃～55℃ 1 min，72℃ 2 min， 30个循环；72℃ 10 min，4℃结束反应。反应结束后对PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳并观察结果。

1.2.4 特异性试验 选取羊痘疫苗、羊口疮疫苗、水疱性口炎疫苗、口蹄疫疫苗，按照上述方法提取DNA，进行PCR扩增，对该方法的特异性进行验证。

1.2.5 灵敏度试验 将0.5 mL羊痘疫苗按上述方法提取DNA，用核酸测定仪测定所提取DNA的浓度，然后进行10倍系列稀释，各取1 μL进行PCR扩增，对其灵敏度进行检测。

1.2.6 临床样品检测 选取疑似羊痘临床样品的全血，血清和痘痂样品9份进行基因组DNA的提取，然后按照上述方法PCR扩增进行山羊痘的诊断。

2 结果

2.1 PCR方法的建立

对退火温度、引物浓度等反应参数进行比较优化，结果显示，以退火温度为50 ℃，引物浓度为100 nmol/L，反应条件为预变性95℃ 5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，扩增30个循环，检测结果最佳(图1)，将得到的目的条带送上海桑尼生物科技公司测序，序列结果如图2，与GTPV疫苗株(AY881707)相比，核苷酸同源性100%(图2)。

M.DNA 标准DL 2 000;1.阴性对照；2.PCR扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.PCR amplification products

图1 PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplification results

图2 GTPV p32基因序列

2.2 PCR的特异性

用相同的方法提取羊痘疫苗、羊口疮疫苗、水疱性口炎疫苗、口蹄疫疫苗的DNA，并以此为模板进行PCR扩增，用10 g/L的琼脂糖进行凝胶电泳，只有羊痘病毒疫苗扩增出一条约983 bp的片段，与预期结果相一致(图3)。而羊口疮疫苗、水疱性口炎疫苗、口蹄疫疫苗均未扩增出条带，表明该方法所扩增的片段为羊痘病毒的特异性片段。

2.3 PCR的灵敏度

将0.5 mL羊痘疫苗按上述方法提取DNA，用核酸测定仪测定所提取DNA的浓度为40 ng/mL，然后进行10倍系列稀释，各取1 μL进行PCR扩增检测，结果稀释到10-5(0.4 pg)仍可检测出条带，说明该方法具有较高的灵敏度(图4)。

1.羊痘疫苗；2.羊口疮疫苗；3.水疱性口炎疫苗；4.口蹄疫疫苗；M.DNA标准DL 2 000;

1.GPTV vaccine;2.ORFV vaccine;3.Vesicular stomatitis virus vaccine;4.FMDV vaccine;M.DNA Marker DL 2 000;

图3特异性试验结果

Fig.3 Specificity test results

2.4 临床样品检测

选取临床疑似羊痘羊的全血、血清和痘痂样品9份进行基因组DNA的提取，然后按照上述方法PCR扩增(图5)。全血和血清共6份样品均未扩增出983 bp的特异性条带，而3份痘痂样品扩增出983 bp羊痘病毒的特异性条带，说明该方法可用于临床诊断。

M.DNA 标准DL 2 000;1～6.羊痘的DNA含量从40 ng/mL递减稀释到10-6

M.DNA Marker DL 2 000;1-6.The content of DNA was decreasing diluted from 40 ng/mL to 10-6

图4灵敏度试验结果

Fig.4 Sensitivity test results

M.DNA 标准DL 2 000;1～3.全血样品；4～6.血清样品；7～9.痘痂样品；10.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.Blood samples;4-6.Serum samples;7-9.Scab samples;10.Negative control

图5临床疑似样品的检测结果

Fig.5 Detection results of clinically suspected samples

3 讨论

山羊痘是一种危害比较严重的接触性传染病，在世界许多国家和地区发生和流行，我国许多地方呈地方性流行，给养羊业带来巨大损失，阻碍了养羊业的发展。榆林市是陕北白绒山羊的主产区，其陕北白绒山羊产业已成为榆林市畜牧业中的王牌产业。由于陕北白绒山羊养殖数量的迅猛增长和饲养方式的转变，使山羊痘发生风险大大增加，山羊痘防控在陕北白绒山羊产业链发展过程中起着至关重要的作用。因此，建立快速诊断的方法是有效减少和控制该病发生的关键所在[8]。本研究方法的建立，改变了以往仅依靠肉眼观察来诊断山羊痘的主观性，大大减少了因主观判断所造成的误差，提高了对该病诊断的科学性和准确性，为该病的科学诊断提供技术手段。

山羊痘在临床症状上与羊口疮、羊口蹄疫等非常相似，对该病的诊断必须依靠实验室方法进行确诊。而血清学试验易出现交叉反应，很难区分[9]。一般来说，病毒病的确诊需要进行病毒分离。一方面，山羊痘病毒的分离需要较高生物安全水平的实验室，一般的实验室的生物安全水平达不到要求；另一方面，山羊痘病毒在细胞上生长十分缓慢，通常培养10 d才能见到较好的细胞病变(CPE)。由于病毒感染的抗体应答水平较低，用血清学检测方法检测羊痘病毒效果不理想[5，10]。传统的实验方法耗时费力且容易出错，因此，建立PCR检测方法可实现对该病的快速、准确诊断，以便采取及时有效的防控措施。

山羊痘病毒为双链DNA病毒，其p32蛋白是世界各地所有羊痘病毒毒株所共有的且特异性很强的结构蛋白。基于该区域的特异性和保守性，本研究针对这个区域设计特异性引物，建立了山羊痘的PCR诊断方法，结果表明,该方法具有较高的特异性和灵敏度。本方法可作为基层实验室快速准确诊断羊痘的有效方法。

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京:中国农业出版社,2006:63-66.

[2] 殷 震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:939-963.

[3] 颜新敏,张 强.羊痘病毒免疫学研究进展[J].动物医学进展,2009,30(12):67-70.

[4] 陈轶霞.羊痘病毒基因组及其功能研究概况[J].中国兽医学报,2015,35(2):340-343.

[5] 施程洪,兰虎云,朱明旺,等.羊痘病毒的研究进展[J].中国兽医杂志,2014,48(9):61-65.

[6] 芦晓立,吴国华,颜新敏,等.山羊痘病毒P32基因与绵羊CD58基因共表达载体的构建及其免疫活性分析[J].中国兽医科学,2015,45(3):298-303.

[7] 裴全帮,张海刚,李光平,等.青海细毛羊羊痘病毒的PCR诊断与病原分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2015(11):112-114.

[8] 张志成,陈丽华,陆静静,等.羊痘病毒PCR检测方法的建立和试剂盒的研制[J].中国动物检验,2011,28(2):44-46.

[9] 高 珊,孟克巴依尔,乌力吉,等.羊痘病毒研究综述[J].甘肃农业科技,2015(1):45-48.

[10] 韩若婵,张 强,吴国华,等.羊痘病毒多重PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2008,38(3):206-208.

DevelopmentandApplicationofPCRforDetectionofGoatPoxVirus

BAI Yan-yan1,ZHANG Bin2,HAO Yu-qing1,GAO Yan1,LIU Wan-hua1,BAI Chong-sheng1, LIU Jian-peng1,HAN Bin1,YANG De-quan3

(1.YulinAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Yulin,Shaanxi,719000,China; 2.YulinAnimalHealthSupervisionInstitute,Yulin,Shaanxi,719000,China； 3.ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai,201103,China)

The purpose of this study was to develop a faster and more accurate diagnostic method.Based on the published reference strains of goat pox virus(GTPV) in GenBank,a pair of primers for p32 gene sequence of GPTV specific amplification were designed and synthesized.The amplified product was approximately 983 bp.After the optimization of reaction condition,a PCR method for detection of GTPV was established and an evaluation on the specificity and sensitivity of reaction system for this method was conducted with detecting 9 clinical samples by this method.The result indicated that this diagnostic method did not generate cross reaction with three kinds of non-capripoxviruses.The minimum concentration of PCR is 0.4 pg.In the clinical samples detected,the number of positive GTPV is 3.The result showred that the method has good specificity and sensitivity,which can be suitable for clinical diagnosis.

Goat pox virus；PCR；sensitivity；specificity

2017-03-06

陕西省农业科技创新转化资金项目(NYKJ-2015-023)；陕西省科技统筹项目(2015KTTSNY04-04)

白艳艳(1985-)，女，陕西佳县人，兽医师，硕士，主要从事动物疫病监测、检测和流行病学调查工作。△同等贡献作者。*

S852.659.1;S854.43

:A

:1007-5038(2017)090-0010-04