化学发光免疫法检测GADA、ICA、ZnT-8A在T1DM诊断中的应用研究

李彦青 赵鸿斌 孙晓慧

·论著·

化学发光免疫法检测GADA、ICA、ZnT-8A在T1DM诊断中的应用研究

李彦青 赵鸿斌 孙晓慧

目的对比分析免疫印迹法(IB法)及化学发光免疫法(CLISA法)检测谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、胰岛细胞抗体(ICA)、锌转运蛋白8抗体(ZnT-8A)结果，探讨这三种抗体联合检测对T1DM的临床意义。方法选取2015年1月至2016年10月内分泌科收治的100例糖尿病患者的临床资料，其中T1DM 32例， T2DM 68例及100例健康人群(健康对照组)，分别采用IB法及化学发光酶免疫法进行GADA、ICA、ZnT-8A检测。结果T1DM组CLISA法检测 GADA、ICA及ZnT-8A，阳性率明显高于T2DM组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；CLISA法检测 GADA、ICA及ZnT-8A，敏感性均高于IB法，差异有统计学意义(P<0.05)；CLISA法检测 ICA及ZnT-8A，特异性均高于IB法，差异有统计学意义(P<0.05)。结论化学发光酶免疫法检测GADA、ICA、ZnT-8A对诊断T1DM有更高的临床价值。

T1DM;GADA;ICA;ZnT-8A;免疫印迹法;化学发光免疫法

糖尿病(DM)是一组以高血糖为典型特征伴有多种并发症的慢性代谢紊乱综合征,多由胰岛素分泌缺陷或生理活性受损所致，已成为当前临床上的主要内分泌代谢疾病，根据发病机制不同，临床上主要分成1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)。T1DM是DM相关抗体对胰岛β细胞进行免疫性破坏，导致胰岛素分泌不足引起的疾病；T2DM则属于非胰岛素依赖性DM，较为常见[1,2]。这种分型主要依据患者临床表现及血胰岛素水平。随着DM免疫标志物研究的进一步发展，DM相关的血清标志物包括GADA、ICA及ZnT-8A，逐步受到研究者的重视，可以为患者提供更合理的临床救治提供参考价值[3-5]。 T1DM是胰腺β细胞发生细胞介导的自身免疫反应损伤引起的，患者血清中可以检测到GADA及ICA等胰岛相关自身抗体[6]。有研究报道，胰岛细胞抗体(ICA)被视为DM的高危指标，其阳性检测率会随着患者病程延长而降低，谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)是一种抑制性神经介质氨基丁酸生物合成酶，持续时间长，且阳性率较高[7]，有研究报道，GADA是两种DM阳性率最高的指标[8,9]。锌转运蛋白8抗体(ZnT-8A)是一种胰岛β细胞分泌颗粒膜蛋白，通过影响锌离子浓度而在胰岛素合成和分泌中发挥重要作用，2007年被确定为T1DM的新的自身抗体[10]。免疫印迹法(IB法)是免疫组织化学分析技术和高分辨率凝胶电泳结合，待测抗原转移到膜上，检测与其发生特异性抗体，目前逐渐成为抗原检测的常用方法。化学发光法是依据待测物浓度和发光强度进行检测的发光分子光谱分析法，灵敏度高，检测时间短，目前在临床应用广泛[11,12]。本研究为进一步探讨T1DM临床特点及差异性，选取100例DM患者的临床资料，其中T1DM 32例， T2DM 68例及100例健康人群(健康对照组)，分别采用免疫印迹法及化学发光酶免疫法对谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、胰岛细胞抗体(ICA)、锌转运蛋白8抗体(ZnT-8A)进三种抗体进行检测，然后对比分析检测结果，比较两种方法的应用效果，进一步探讨这三种抗体联合检测对T1DM诊断的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2016年10月石家庄市第一医院收治的首次诊断DM患者100例，其中T1DM 32例，T2DM 68例及100例健康人群(健康对照组)，均符合1999年WHO制定的DM诊断标准，排除继发性DM及妊娠性DM。T1DM组患者共32例，其中男15例，女17例;年龄8～23岁，平均年龄(13.1±5.22)岁；T2DM组患者68例，其中男38例，女30例;年龄28～61岁，平均年龄(38.14±7.61)岁；另外选取同时期本院健康体检者100例，其中男51例，女49例;年龄17～62岁，平均年龄(24.23±10.38)岁；无DM家族史，空腹血糖正常。

1.2 方法

1.2.1 标本采集:分别采集3组患者空腹新鲜血标本4 ml，室温放置30 min血液凝固后，以3 000 r/min的速度离心10 min后留取血清，-20℃冻存备用。

1.2.2 化学发光免疫法检测GADA、ICA及ZnT-8A：GADA、ICA及ZnT-8A化学发光免疫试剂盒购自深圳新产业生物有限公司生产的试剂盒，严格按照试剂说明书进行操作，仪器选用半自动LUMINO发光仪，血清GADA>30 U/ml即为阳性，血清ICA>100 U/ml即为阳性，血清ZnT-8A>50 U/ml即为阳性。

1.2.3 免疫印迹法检测GADA、ICA及ZnT-8A：糖尿病自身免疫抗体GADA、ICA及ZnT-8A试剂盒购自深圳亚龙辉生物有限公司生产的试剂盒，严格按照试剂说明书进行操作，用标准对照带图观察特定区域条带，显色深于弱阳性质控带颜色为阳性，显色弱于弱阳性质控带颜色为阴性。

1.3 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清GADA、ICA及ZnT-8A检测结果

2.1.1 CLISA法检测结果： T1DM组GADA阳性率为46.88%(15/32)、ICA阳性率为34.38%(11/32)及ZnT-8A阳性率为40.63%(13/32)；T2DM组GADA阳性率为30.88%(21/68)、ICA阳性率为26.47%(18/68)及ZnT-8A阳性率为11.76%(8/68)；健康对照组GADA阳性率为3.0%(3/100)、ICA阳性率为1.0%(1/100)及ZnT-8A阳性率为2.0%(2/100)。T1DM组和T2DM组GADA、ICA及ZnT-8A阳性率均明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；T1DM组GADA、ICA及ZnT-8A阳性率明显高于T2DM组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.1.2 IB法检测结果：T1DM组GADA阳性率为18.75%(6/32)、ICA阳性率为18.75%(6/32)及ZnT-8A阳性率为21.88%(7/32)；T2DM组GADA阳性率为10.29%(7/68)、ICA阳性率为14.71%(10/68)及ZnT-8A阳性率为10.29%(7/68)；健康对照组GADA阳性率为3.0%(3/100)、ICA阳性率为3.0%(3/100)及ZnT-8A阳性率为1.0%(1/100)。结果显示，T1DM组和T2DM组GADA、ICA及ZnT-8A阳性率均明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；T1DM组GADA、ICA及ZnT-8A阳性率明显高于T2DM组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.1.3 CLISA法和IB法检测结果：T1DM组和T2DM组CLISA法检测GADA、ICA及ZnT-8A阳性率明显高于IB法，差异有统计学意义(P<0.05)；健康对照组CLISA法检测GADA、ICA及ZnT-8A阳性率与IB法比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 两种方法检测3组受试着血清GADA、ICA及ZnT-8A比较 例

注：与对照组比较，*P<0.05,#P<0.01；与T1DM组比较，△P<0.05

2.2 GADA、ICA及ZnT-8A敏感性和特异性检测结果 CLISA法检测 GADA、ICA及ZnT-8A，敏感性均明显高于IB法(P<0.05)；特异性亦均高于IB法，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两种方法检测血清GADA、ICA及ZnT-8A敏感性和特异性比较 %

注：与IB法比较，*P<0.05

2.3 GADA、ICA及ZnT-8A联合检测结果 GADA、ICA及ZnT-8A三种抗体联合检测结果，T1DM组CLISA法阳性率65.63%(21/32)，IB法阳性率34.38%(11/32)；T2DM组CLISA法阳性率42.65%(29/68)，IB法阳性率20.59%(14/68)；健康对照组CLISA法阳性率6.0%(6/100)，IB法阳性率7.0%(7/100)。T1DM组和T2DM组阳性率明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，T1DM组阳性率明显高于T2DM组(P<0.05)；T1DM组和T2DM组CLISA法检测阳性率明显高于IB法，差异有统计学意义(P<0.05)；健康对照组CLISA法检测阳性率与IB法比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两种方法GADA、ICA及ZnT-8A联合检测阳性率比较 例

注：与健康对照组比较，*P<0.01；与T1DM组比较，#P<0.05；与CLISA法比较，△P<0.05

3 讨论

中国DM患者近1亿，高危人群约1.5亿，其发病率呈明显的上升和年轻化趋势。其中T1DM患者亦在不断的增多，其生存现状亦不容乐观。如果能有更高临床价值的检测方法发现现在的T1DM患者，使其疾病控制在未发或者初发阶段，必将大大的改善T1DM患者的生存现状，提高其生活质量并延长寿命。

近年来发现DM和其他多种自身免疫性疾病一样，在临床症状出现前数月或数年即可出现自身抗体阳性，其初期表现可能是一种或者少量自身抗原的抗体，之后便发展为针对多种抗原的自身抗体。

DM自身抗体是DM发病过程中胰岛自身免疫损伤而产生的，主要包括GADA、IA-2A、ICA、IAA及ZnT-8A，在T1DM患者及T2DM患者中均可检测出一定阳性率的胰岛自身抗体[9]。有报道显示胰岛自身抗体阳性人群中60%～70%经数月或数年随访后发生T1DM[9]。

GADA是T1DM患者体内出现最早的抗体，GADA是由于机体感染柯萨奇病毒后，病毒蛋白系列与谷氨酸脱羧酶的氨基酸系列相似而发生的交叉免疫反应而产生，是由分泌谷氨酸脱羧酶生成γ-氨基丁酸的神经细胞和非神经细胞组织合成的，GADA一旦生成可与谷氨酸脱羧酶结合，使之失去活性，干扰胰岛素合成与分泌。GADA阳性预示内分泌胰岛素的缺乏或缺失，是胰岛素功能减退速度的主要预测因子，有预测胰岛功能的价值，属于T1DM的自身抗体[4]。有报道认为GADA是破坏胰岛细胞，引起T1DM的关键抗原，可能是T1DM自身免疫的始动靶抗原，与其他抗体相比，GADA与胰岛β细胞损坏相关性好，在患者体内持续时间长且随病程延长下降幅度很小，阳性率高[6]，是诊断T1DM和LADA最敏感且应用最广泛的指标之一。ICA 是针对胰岛β细胞胞浆成分的混合抗体。ICA的阳性率与病程长短有关，随着病程延长逐渐下降，可能与抗原的减少或消失有关。ZnT-8A是2007年新发现的一种与T1DM相关的非常重要的自身抗体[10]。ZnT8蛋白为基因SLC30A8(染色体8q24.11)所编码，属于锌转运体(ZnT/SLC30)家族成员，仅在胰岛β细胞高表达，分布在胰岛细胞中含有胰岛素颗粒的囊泡膜上，ZnT8能促进细胞质中锌转移至有胰岛素颗粒的囊泡中储存起来，当胰岛β细胞受到刺激时如高血糖，即通过胞吐作用将其分泌出去；ZnT8通过影响Zn在胰岛素颗粒中的聚集从而影响胰岛素的稳定、储存及分泌。因此，ZnT-8A的出现成为了异常体液免疫应答攻击胰岛β细胞的标志。ZnT-8A的发现不仅有助于提高对T1DM的认识，对临床上预测和诊断T1DM有十分重大的价值。

本研究选取2015年1月至2016年1月我院内分泌科收治的100例糖尿病患者的临床资料，其中T1DM 32例， T2DM 68例及100例健康人群(健康对照组)，分别采用免疫印迹法及化学发光免疫法对GADA、ICA、ZnT-8A三种抗体进行检测。通过检测方法的灵敏度及阳性率进行对比，T1DM组CLISA法检测 GADA、ICA及ZnT-8A，阳性率明显高于T2DM组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；CLISA法检测 GADA、ICA及ZnT-8A，敏感性均高于IB法，差异有统计学意义(P<0.05)；CLISA法检测 ICA及ZnT-8A，特异性性均高于IB法，差异有统计学意义(P<0.05)；GADA、ICA及ZnT-8A三种抗体联合检测，T1DM组和T2DM组用CLISA法检测阳性率明显高于IB法，差异有统计学意义(P<0.05)。T1DM组分别检测GADA、ICA及ZnT-8A三种抗体阳性率明显高于T2DM组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；T1DM组三种抗体联合检测阳性率亦明显高于T2DM组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。这一结果提示，GADA、ICA及ZnT-8A三种抗体检测对于T1DM患者的发现具有很好的应用价值，且应用化学发光免疫法联合检测三种抗体对T1DM患者具有更高的临床价值，值得临床推广及普及运用。

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