口蹄疫病毒L、2B基因siRNA重组腺病毒质粒的构建

贾俊涛++郭凤英++乌伦吉如嘎++张小宇++陈金顶

摘要：根据siRNA设计原则，分别选择O型FMDV的L和2B基因上保守序列作为可能的干扰位点，设计了2个siRNAs，并将siRNAs克隆到pSIREN-Shuttle中，获得2个siRNA重组表达载体pShuttle-L和pShuttle-2B。用限制性内切酶I-Ceu I和PI-Sce I双酶切siRNA重组表达载体和腺病毒质粒载体pAdeno-X，利用体外连接法获得了重组质粒。经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定，成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-L和pAdeno-2B。

关键词：口蹄疫病毒；RNA干扰；重组腺病毒质粒

中图分类号：S852.65+9.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）16-3152-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.039

Construction of Recombinant Adenovirus Plasmid Containing the L and 2B Gene siRNAs of Foot-and-Mouth Disease Virus

JIA Jun-tao1，GUO Feng-ying1，Wulunjiruga1，ZHANG Xiao-yu1，CHEN Jin-ding2

（1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricuitural University， Baotou 014109， Inner Mongolia， China；

2.South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China）

Abstract： In this study， the conservative sequence in L and 2B gene of O type FMDV were chose as possible interference sites. Two siRNAs were designed and synthesized. These siRNAs were cloned into the plasmid pSIREN-Shuttle， then the siRNAs recombined expression vectors were obtained including pShuttle-L and pShuttle-2B. The vectors and the adenovirus vector pAdeno-X were digested with restriction endonuclease I-Ceu I and PI-Sce I and connected in vitro， then recombinant plasmids were obtained. The result of PCR， enzyme-cutting and sequencing suggested that the recombined adenovirus plasmids pAdeno-L and pAdeno-2B were constructed successfully.

Key words： Foot-and-mouth disease virus（FMDV）； RNA interference（RNAi）； recombinant adenovirus plasmid

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]。它不仅可使动物生产性能下降，而且还限制动物及动物产品的国际贸易，有“政治经济病”之称，被OIE列为烈性传染病之首[2]。由于FMDV感染率高、传染性强、患病动物排毒量大，可使爆发地区遭受巨大经济损失，因此该病是世界各国检疫和防疫的重点对象。目前，采用免疫接种与扑杀相结合，再辅以封杀、隔离、消毒、抗体检测等综合措施，但仍不能控制FMDV的感染与传播，这就迫使人们寻求更加有效的防控方法。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一项可以在体外有效抑制病毒复制的技术，其是由与靶基因序列同源的dsRNA引发广泛存在于动植物中的序列特异性基因转录后的沉默过程[3]。腺病毒载体因具有感染细胞种类多、感染效率高、外源基因表达水平高，且既适于体外又适于体内研究等特点而被作为转基因载体[4]。本研究构建了携带有O型FMDV L、2B基因siRNA片段的重组腺病毒质粒，为研究腺病毒介导的RNAi抑制FMDV增殖的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、质粒和菌株 FMDV O/HKN/2003由华南农业大学兽医学院微生物实验室保存。E1、E3区缺失的腺病毒质粒载体pAdeno-X、穿梭质粒pSIREN-shuttle由广州医学院李彬教授惠赠。大肠杆菌DH5α购自广州合达生物技术公司。

1.1.2 主要试剂 归位内切酶I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ购自NEB公司。去内毒素质粒小量抽提试剂盒为OMEGA公司产品；DNA转染试剂Lipofectamine2000为Invitrogen产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据腺病毒质粒pAdeno-X序列和归位内切酶I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ的识别序列，设计下列引物：P1：5′-CGGGAAAACTGAATAAGACG-3′；P2：5′-CATCAAACGAGTTGGTGCT-3′，引物由北京賽百盛生物技术有限公司合成。endprint

1.2.2 siRNA表達质粒的获得 根据siRNA的设计原则[5]，以GenBank中O型FMDV基因组核苷酸序列以及现有的FMDV株O/HKN/2003的序列测定结果，选择非结构蛋白L、2B基因保守序列作为可能的干扰位点，设计了含有siRNA序列的寡核苷酸片段，命名为siRNA-L、siRNA-2B。将siRNA寡核苷酸片段克隆到pSIREN-Shuttle中，经过鉴定获得阳性克隆。

1.2.3 重组腺病毒穿梭质粒载体的获得 提取鉴定正确的重组质粒及腺病毒质粒载体pAdeno-X分别进行I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ双酶切，回收酶切产物，连接回收产物，转化大肠杆菌DH5α。以P1、P2为引物进行菌落PCR，筛选阳性克隆。PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。同时采用质粒PCR、Pac Ⅰ酶切及测序鉴定。

2 结果与分析

2.1 菌落PCR鉴定

在转化的平板上各选取5个菌落进行菌落PCR来初步筛选阳性克隆，经1%琼脂糖凝胶电泳后，分别有4个菌落扩增出大小为600 bp左右的电泳条带，其大小与预期相符（图1、图2）。

2.2 重组腺病毒质粒载体PCR鉴定

菌落PCR筛选后，以质粒为模板，进行质粒PCR鉴定，扩增出大小约600 bp的电泳条带，其大小与预期相符（图3），进一步证实阳性重组子的可能性。

2.3 重组腺病毒质粒载体的酶切鉴定

将可能的阳性重组子用Pac Ⅰ酶切后出现两条亮带，一条在3 000 bp左右，另一条在30 kb左右，与预期相符（图4）。结果表明，重组质粒构建成功。

2.4 重组质粒载体的序列测定

将质粒PCR鉴定为阳性的重组质粒载体pAdeno-L、pAdeno-2B进行序列测定，结果与预期序列完全吻合（图5、图6）。

3 小结与讨论

口蹄疫是目前危害世界养殖业的重要疾病之一。FMDV灭活疫苗防治是目前防治该病的重要手段之一，但这种预防措施只能给动物提供短期保护，而且存在病毒逃逸和病毒灭活不彻底的潜在危险。迅速发展的RNAi技术已经使其成为一种功能强大的研究动物特定基因表达和功能的工具[3]。已有报道表明，通过人工转染siRNA能够有效地诱发RNAi抵抗病毒的感染[6]。由于RNAi技术的快速性和特异性，可以弥补目前已有的病毒防御手段的不足。口蹄疫病毒的基因组是一条单链RNA，其既作为信使RNA又作为复制模板行使功能，因此口蹄疫是利用RNA干扰技术防制的理想对象。

本研究选择了FMDV L、2B基因保守序列作为可能的干扰位点，并设计了含有相应siRNA序列的寡核苷酸片段。FMDV基因组为单股正链RNA，其基因组RNA具有mRNA性质。L、2B基因属于FMDV的非结构蛋白基因。在FMDV的复制过程中，Lpro可特异性地降解宿主翻译起始因子eIF-4G，导致宿主依赖cap的mRNA翻译关闭[7，8]。Lpro对宿主蛋白质合成具有抑制作用，因此认为是FMDV的毒力因子。2B基因编码的2B蛋白具有辅助病毒诱导细胞病变作用，现已表明2B蛋白能增强膜的通透性和阻断蛋白分泌途径。FMDV的L和2B基因在病毒复制周期中发挥重要作用，因此，如果L、2B基因的表达被抑制，就会抑制病毒的增殖。

RNAi表达载体有质粒载体[9]和病毒载体[10，11]，其中病毒载体克服了质粒转染细胞效率低的缺点，并可体内应用，实现长时间的靶基因沉默，具有临床应用前景等优势。腺病毒是目前转基因效率最高的载体之一，被广泛用于基因治疗、基因功能性研究等领域。目前用于基因治疗的腺病毒载体多为复制缺陷型载体，即缺失了腺病毒基因组中某些复制增殖所必需的基因，这部分基因的功能由辅助细胞或病毒提供。本研究采用复制缺陷型腺病毒载体，使用体外连接的方法成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-L和pAdeno-2B，为研究腺病毒介导的RNAi抑制FMDV增殖的作用奠定了基础。

参考文献：

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